304 Roostevabast terasest keevitatud spiraaltoru / toru keemiline komponent, globaalse meremikrobiomi biosünteetiline potentsiaal

Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Kasutate piiratud CSS-i toega brauseri versiooni.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Lisaks näitame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiilide ja JavaScriptita.
Liugurid, mis näitavad kolme artiklit slaidi kohta.Kasutage slaidide vahel liikumiseks nuppu Tagasi ja Järgmine või igal slaidil liikumiseks lõpus olevaid slaidijuhtnuppe.

Toote üksikasjalik kirjeldus

304 Roostevabast terasest keevitatud spiraaltoru/toru
1. Spetsifikatsioon: roostevabast terasest spiraaltoru / torud
2. Tüüp: keevitatud või õmblusteta
3. Standard: ASTM A269, ASTM A249
4. Roostevabast terasest spiraaltoru OD: 6 mm kuni 25,4 mm
5. Pikkus: 600-3500MM või vastavalt kliendi soovile.
6. Seina paksus: 0,2 mm kuni 2,0 mm.

7. Tolerants: OD: +/-0,01mm;Paksus: +/-0,01%.

8. Mähise sisemine ava suurus: 500-1500 mm (saab kohandada vastavalt kliendi nõudmistele)

9. Rulli kõrgus: 200-400 mm (saab reguleerida vastavalt kliendi nõudmistele)

10. Pind: hele või lõõmutatud
11. Materjal: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, sulam 625, 825, 2205, 2507 jne.
12. Pakkimine: kootud kotid puitkarbis, puidust kaubaaluses, puidust võllis või vastavalt kliendi soovile
13. Katse : keemiline komponent, voolavuspiir, tõmbetugevus, kõvaduse mõõtmine
14. Garantii: Kolmanda osapoole (näiteks :SGS TV ) ülevaatus jne.
15. Kasutusala: kaunistus, mööbel, õli transport, soojusvaheti, reelingute valmistamine, paberi valmistamine, auto, toiduainete töötlemine, meditsiin jne.

Looduslikud mikroobikooslused on fülogeneetiliselt ja metaboolselt mitmekesised.Lisaks väheuuritud organismirühmadele1 on sellel mitmekesisusel ka rikkalik potentsiaal ökoloogiliselt ja biotehnoloogiliselt oluliste ensüümide ja biokeemiliste ühendite avastamiseks2,3.Selle mitmekesisuse uurimine, et määrata kindlaks genoomilised rajad, mis selliseid ühendeid sünteesivad ja nende vastavate peremeestega seovad, on endiselt väljakutse.Mikroorganismide biosünteetiline potentsiaal avaookeanis on suures osas teadmata, kuna kogu genoomi eraldusvõime andmete analüüsimisel globaalsel skaalal on piiranguid.Siin uurime ookeani biosünteetiliste geeniklastrite mitmekesisust ja mitmekesisust, integreerides umbes 10 000 mikroobi genoomi kultiveeritud rakkudest ja üksikutest rakkudest enam kui 25 000 äsja rekonstrueeritud genoomiga enam kui 1000 mereveeproovist.Need jõupingutused on tuvastanud umbes 40 000 oletatavat, peamiselt uut biosünteetilist geeniklastrit, millest mõned on leitud varem kahtlustamatutest fülogeneetilistest rühmadest.Nendes populatsioonides tuvastasime biosünteetiliste geeniklastritega ("Candidatus Eudormicrobiaceae") rikastatud liini, mis kuulus kasvatamata bakterite rühma ja hõlmas mõnda selle keskkonna biosünteetiliselt kõige mitmekesisemat mikroorganismi.Neist oleme iseloomustanud fosfataasi-peptiidi ja pütonamiidi radu, tuvastades vastavalt ebatavalise bioaktiivse ühendi struktuuri ja ensümoloogia juhtumeid.Kokkuvõttes näitab see uuring, kuidas mikrobioomipõhised strateegiad võivad võimaldada varem kirjeldamata ensüümide ja looduslike toiduainete uurimist halvasti mõistetavas mikrobiotas ja keskkonnas.
Mikroobid juhivad globaalseid biogeokeemilisi tsükleid, säilitavad toiduvõrke ning hoiavad taimi ja loomi tervena5.Nende tohutu filogeneetiline, metaboolne ja funktsionaalne mitmekesisus kujutab endast rikkalikku potentsiaali uute taksonite1, ensüümide ja biokeemiliste ühendite, sealhulgas loodustoodete6 avastamiseks.Ökoloogilistes kooslustes pakuvad need molekulid mikroorganismidele mitmesuguseid füsioloogilisi ja ökoloogilisi funktsioone, alates suhtlemisest kuni konkurentsini 2, 7 .Lisaks oma algsetele funktsioonidele pakuvad need looduslikud tooted ja nende geneetiliselt kodeeritud tootmisviisid näiteid biotehnoloogiliste ja terapeutiliste rakenduste jaoks2,3.Selliste radade ja ühenduste tuvastamist on oluliselt hõlbustanud kultiveeritud mikroobide uurimine.Looduskeskkonna taksonoomilised uuringud on aga näidanud, et valdav osa mikroorganismidest on kultiveerimata8.See kultuuriline eelarvamus piirab meie võimet kasutada ära paljude mikroobide poolt kodeeritud funktsionaalset mitmekesisust 4, 9.
Nendest piirangutest ülesaamiseks on viimase kümnendi jooksul tehtud tehnoloogilised edusammud võimaldanud teadlastel otse (st ilma eelneva kultiveerimiseta) järjestada mikroobseid DNA fragmente tervetest kooslustest (metagenoomika) või üksikutest rakkudest.Võimalus koondada need fragmendid suuremateks genoomi fragmentideks ja rekonstrueerida vastavalt mitu metagenoomiliselt kokkupandud genoomi (MAG) või üksikut amplifitseeritud genoomi (SAG), avab olulise võimaluse mikrobioomi (st mikroobikoosluste ja mikrobioomi) taksotsentrilisteks uuringuteks.sillutada uusi teid.oma geneetiline materjal antud keskkonnas) 10,11,12.Tõepoolest, hiljutised uuringud on oluliselt laiendanud mikroobide mitmekesisuse fülogeneetilist esitust Maal1, 13 ja on paljastanud suure osa funktsionaalsest mitmekesisusest üksikutes mikroobikooslustes, mida varem ei hõlmanud kultiveeritud mikroorganismide võrdlusgenoomi järjestused (REF)14.Võimalus paigutada avastamata funktsionaalne mitmekesisus peremeesgenoomi konteksti (st genoomi eraldusvõime) on kriitilise tähtsusega seni iseloomustamata mikroobiliinide ennustamiseks, mis arvatavasti kodeerivad uusi looduslikke tooteid15, 16 või selliste ühendite jälitamiseks nende algse tootjani17.Näiteks kombineeritud metagenoomilise ja üherakulise genoomse analüüsi lähenemisviis on viinud Candidatus Entotheonella, metaboolselt rikaste käsnadega seotud bakterite rühma tuvastamiseni mitmesuguste ravimipotentsiaalide tootjatena18.Hoolimata hiljutistest katsetest uurida erinevate mikroobikoosluste genoomi, on enam kui kaks kolmandikku Maa suurima ökosüsteemide ookeani 16, 20 globaalsetest metagenoomilistest andmetest endiselt puudu.Seega on mere mikrobiomi biosünteetiline potentsiaal ja selle potentsiaal uudsete ensümaatiliste ja looduslike toodete hoidlana suures osas alauuritud.
Mere mikrobioomide biosünteesipotentsiaali globaalsel skaalal uurimiseks ühendasime esmalt mere mikroobide genoomid, mis saadi kultuurist sõltuvate ja mittekultuuriliste meetodite abil, et luua ulatuslik fülogeneetika ja geenifunktsiooni andmebaas.Selle andmebaasi uurimine paljastas laias valikus biosünteetilisi geeniklastreid (BGC), millest enamik kuulub veel iseloomustamata geeniklastri (GCF) perekondadesse.Lisaks tuvastasime tundmatu bakterite perekonna, millel on seni suurim teadaolev BGC-de mitmekesisus avaookeanis.Valisime eksperimentaalseks valideerimiseks kaks ribosomaalse sünteesi ja translatsioonijärgselt modifitseeritud peptiidi (RiPP) rada, mis põhinevad nende geneetilistel erinevustel praegu teadaolevatest radadest.Nende radade funktsionaalne iseloomustus on paljastanud ootamatuid näiteid ensümoloogiast ja struktuurselt ebatavalisi proteaasi inhibeeriva toimega ühendeid.
Alguses püüdsime luua genoomianalüüsi jaoks globaalse andmeressursi, keskendudes selle bakteriaalsetele ja arheoloogilistele komponentidele.Sel eesmärgil ühendasime metagenoomilised andmed ja 1038 mereveeproovi 215 globaalselt jaotunud proovivõtukohast (laiuskraadide vahemik = 141, 6 °) ja mitmest sügavast kihist (sügavusega 1 kuni 5600 m, hõlmates pelaagilisi, mesopelagilisi ja sügaviku tsoone).Taust 21, 22, 23 (joonis 1a, laiendatud andmed, joonis 1a ja täiendav tabel 1).Lisaks laiale geograafilisele katvusele võimaldasid need selektiivselt filtreeritud proovid võrrelda mere mikrobioomi erinevaid komponente, sealhulgas viiruserikkaid (<0,2 µm), prokarüootseid rikkaid (0,2–3 µm), osakeste rikkaid (0,8 µm). ).–20 µm) ja viirustest vaesestatud (>0,2 µm) kolooniad.
a, Kokku 1038 avalikult kättesaadavat mere mikroobikoosluste genoomi (metagenoomikat), mis on kogutud 215 globaalselt hajutatud kohast (62°S kuni 79°N ja 179°W kuni 179°E).Kaardiplaadid © Esri.Allikad: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ ja Esri.b, neid metagenoome kasutati MAG-ide (meetodid ja lisateave) rekonstrueerimiseks, mis erinevad andmekogumite (märgitud värviga) koguse ja kvaliteedi (meetodid) poolest.Rekonstrueeritud MAG-e täiendati avalikult kättesaadavate (väliste) genoomidega, sealhulgas käsitsi valmistatud MAG26, SAG27 ja REF.27 Koostage OMD.c, võrreldes eelmiste aruannetega, mis põhinevad ainult SAG (GORG)20 või MAG (GEM)16 andmetel, parandab OMD mere mikroobikoosluste genoomilist iseloomustamist (metagenoomse lugemise kaardistamise kiirus; meetod) kaks kuni kolm korda, pakkudes järjepidevamat sügavust ja esindatust. laiuskraad..<0,2, n = 151, 0,2-0,8, n = 67, 0,2-3, n = 180, 0,8-20, n = 30, >0,2, n = 610, <30°, n = 132, 30-60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD rühmitamine liikide klastrite tasemel (95% keskmine nukleotiidide identsus) tuvastab kokku Ligikaudu 8300 liiki, millest enam kui pooli ei ole varem taksonoomiliste annotatsioonide järgi iseloomustatud GTDB (versioon 89) e abil, näitas liikide klassifikatsioon genoomitüübi järgi, et MAG, SAG ja REF täiendavad üksteist hästi, peegeldades filogeneetilist mitmekesisust. mere mikrobioom.Eelkõige olid 55%, 26% ja 11% liikidest spetsiifilised vastavalt MAG, SAG ja REF suhtes.BATS, Bermuda Atlandi ajaseeria;GEM, Maa mikrobioomi genoomid;GORG, globaalse ookeani võrdlusgenoom;KUUM, Hawaii ookeani aegrida.
Seda andmekogumit kasutades rekonstrueerisime kokku 26 293 MAG-i, enamasti bakteriaalsed ja arheaalsed (joonis 1b ja laiendatud andmed, joonis 1b).Lõime need MAG-id eraldi, mitte koondatud metagenoomiliste proovide komplektidest, et vältida erinevatest kohtadest või ajapunktidest pärit proovide (meetodite) loomuliku järjestuse varieeruvuse kokkuvarisemist.Lisaks rühmitasime genoomsed fragmendid nende levimuskorrelatsioonide põhjal suure hulga proovide vahel (58 kuni 610 proovi, olenevalt uuringust; meetod).Leidsime, et tegemist on aeganõudva, kuid olulise sammuga24, mis jäi mitme suuremahulise MAG16, 19, 25 rekonstrueerimistöö puhul vahele ning parandab oluliselt (keskmiselt 2,7 korda) ja kvaliteeti (keskmiselt +20%). genoom.rekonstrueeritud siin uuritud mere metagenoomist (laiendatud andmed, joonis 2a ja lisateave).Kokkuvõttes tõid need jõupingutused kaasa mere mikroobide MAG-de 4,5-kordse suurenemise (6 korda, kui arvestada ainult kvaliteetseid MAG-e) võrreldes kõige ulatuslikuma tänapäeval saadaoleva MAG-ressursiga16 (meetodid).See äsja loodud MAG komplekt ühendati seejärel 830 käsitsi valitud MAG26, 5969 SAG27 ja 1707 REF-iga.Kakskümmend seitse merebakterite ja arhealiiki moodustasid 34 799 genoomist koosneva kombinatoorse kollektsiooni (joonis 1b).
Seejärel hindasime vastloodud ressurssi, et parandada selle võimet esindada mere mikroobide kogukondi ja hinnata erinevate genoomitüüpide integreerimise mõju.Keskmiselt leidsime, et see katab ligikaudu 40–60% mere metagenoomilistest andmetest (joonis 1c), mis on kaks kuni kolm korda suurem kui varasemate ainult MAG-aruannete katvus nii sügavuse kui laiuskraadi osas.Lisaks märgistasime väljakujunenud kogudes taksonoomilise mitmekesisuse süstemaatiliseks mõõtmiseks kõik genoomid, kasutades genoomi taksonoomia andmebaasi (GTDB) tööriistakomplekti (meetodeid) ja kasutasime keskmist genoomi hõlmavat nukleotiidide identiteeti 95%.28 8304 liigiklastri (liigi) tuvastamiseks.Kaks kolmandikku nendest liikidest (kaasa arvatud uued klaad) ei olnud varem GTDB-s ilmunud, millest 2790 avastati selles uuringus rekonstrueeritud MAG-i abil (joonis 1d).Lisaks avastasime, et erinevat tüüpi genoomid on väga komplementaarsed: 55%, 26% ja 11% liikidest koosnevad täielikult vastavalt MAG-st, SAG-st ja REF-ist (joonis 1e).Lisaks hõlmas MAG kõiki 49 veesambas leitud tüüpi, samas kui SAG ja REF esindasid neist vastavalt 18 ja 11.Kuid SAG esindab paremini kõige levinumate klaade (laiendatud andmed, joonis 3a), nagu Pelagic Bacteriales (SAR11), mitmekesisust, SAG hõlmab peaaegu 1300 liiki ja MAG ainult 390 liiki.Nimelt kattusid REF-id harva liigitasandil MAG-ide või SAG-dega ja moodustasid üle 95% ligikaudu 1000 genoomist, mida siin uuritud avatud ookeani metagenoomilistes komplektides ei leitud, peamiselt interaktsioonide tõttu teist tüüpi isoleeritud tüüpiliste merenäidistega (nt setetega). .või host-partner).Teadusringkondadele laialdaselt kättesaadavaks muutmiseks saab seda meregenoomiressurssi, mis sisaldab ka klassifitseerimata fragmente (nt prognoositud faagidest, genoomsaartest ja genoomi fragmentidest, mille kohta pole MAG-i rekonstrueerimiseks piisavalt andmeid), võrrelda taksonoomiliste andmetega. .Juurdepääs annotatsioonidele koos geenifunktsioonide ja kontekstuaalsete parameetritega ookeani mikrobioloogia andmebaasis (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Seejärel asusime uurima avatud ookeani mikrobioomide biosünteesipotentsiaali rikkust ja uudsust.Selleks kasutasime kõigepealt antiSMASH-i kõigi MAG-ide, SAG-ide ja REF-ide jaoks, mis leiti 1038 mere metagenoomist (meetodist), et ennustada kokku 39 055 BGC-d.Seejärel rühmitasime need 6907 mitteliigne GCF-i ja 151 geeniklastri populatsiooni (GCC; täiendav tabel 2 ja meetodid), et võtta arvesse loomupärast liiasust (st sama BGC saab kodeerida mitmes genoomis) ja metagenoomilisi andmeid. Kontsentreeritud BGC-de killustatus .Mittetäielikud BGC-d ei suurendanud märkimisväärselt GCF-de ja GCC-de arvu, kui neid oli (täiendav teave), mis sisaldasid vähemalt ühte puutumatut BGC-liiget 44% ja 86% juhtudest.
GCC tasemel leidsime suure hulga ennustatud RiPP-sid ja muid looduslikke tooteid (joonis 2a).Nende hulgas kuuluvad näiteks arüülpolüeenid, karotenoidid, ektoiinid ja siderofoorid GCC-desse, millel on lai fülogeneetiline jaotus ja suur arvukus ookeani metagenoomides, mis võib viidata mikroorganismide laialdasele kohanemisele merekeskkonnaga, sealhulgas resistentsusele reaktiivsete hapnikuliikide suhtes. oksüdatiivne ja osmootne stress..või raua imendumine (lisateave).See funktsionaalne mitmekesisus vastandub hiljutisele analüüsile, mis hõlmas ligikaudu 1,2 miljonit BGC-d ligikaudu 190 000 genoomi hulgas, mis on salvestatud NCBI RefSeq andmebaasis (BiG-FAM/RefSeq, edaspidi RefSeq)29, mis näitas, et mitteribosomaalsed süntetaasi ja polüketiidi süntetaasi (NRPS) (PKS) BGC-d (täiendav teave).Samuti leidsime 44 (29%) GCC-d, mis olid ainult kaugelt seotud mis tahes RefSeq BGC-ga (\(\bar{d}\)RefSeq > 0,4; joonis 2a ja meetodid) ja 53 (35%) GCC-d ainult MAG-is, tuues esile potentsiaali OMD-s varem kirjeldamata kemikaalide tuvastamiseks.Arvestades, et kõik need GCC-d esindavad tõenäoliselt väga erinevaid biosünteetilisi funktsioone, analüüsisime täiendavalt andmeid GCF-i tasemel, et luua üksikasjalikum BGC-de rühmitus, mis eeldatavasti kodeerib sarnaseid looduslikke tooteid29.Kokku 3861 (56%) tuvastatud GCF-i ei kattunud RefSeqiga ja> 97% GCF-idest ei olnud MIBiG-s, mis on üks suurimaid eksperimentaalselt valideeritud BGC-de andmebaase (joonis 2b).Kuigi pole üllatav avastada palju potentsiaalseid uudseid radu seadetes, mida võrdlusgenoom hästi ei esinda, erineb meie meetod BGC-de dereplitseerimiseks GCF-ideks enne võrdlusuuringut eelmistest aruannetest 16 ja võimaldab meil anda uudsuse erapooletu hinnangu.Suurem osa uuest mitmekesisusest (3012 GCF ehk 78%) vastab ennustatud terpeenidele, RiPP-le või muudele looduslikele saadustele ning enamik (1815 GCF ehk 47%) on nende biosünteesipotentsiaali tõttu kodeeritud tundmatutesse tüüpidesse.Erinevalt PKS-i ja NRPS-klastritest on need kompaktsed BGC-d metagenoomilise montaaži ajal vähem tõenäoliselt killustatud 31 ja võimaldavad nende toodete aja- ja ressursimahukamat funktsionaalset iseloomustamist.
Kokku rühmitati 39 055 BGC-d 6907 GCF-ks ja 151 GCC-ks.a, andmete esitus (sisemine väline).BGC kauguste hierarhiline rühmitamine GCC põhjal, millest 53 fikseerib ainult MAG.GCC sisaldab BGC-sid erinevatest taksonitest (ln-transformeeritud värava sagedus) ja erinevatest BGC klassidest (ringi suurus vastab selle sagedusele).Iga GCC puhul tähistab välimine kiht BGC-de arvu, levimust (proovide protsent) ja kaugust (minimaalne BGC koosinuskaugus (min (dMIBiG))) BiG-FAM-ist BGC-ni.GCC-d, mille BGC-d on tihedalt seotud eksperimentaalselt kontrollitud BGC-dega (MIBiG), on esile tõstetud nooltega.b Võrreldes GCF-i prognoositud (BiG-FAM) ja eksperimentaalselt valideeritud (MIBiG) BGC-dega, leiti 3861 uut (d–>0,2) GCF-i.Enamik (78%) neist kodeerib RiPP-d, terpeene ja muid oletatavaid loodustooteid.c, kõik 1038 mere metagenoomist leitud OMD genoomid paigutati GTDB aluspuusse, et näidata OMD fülogeneetilist katvust.Klaadid, millel pole OMD-s genoome, on näidatud hallina.BGC-de arv vastab suurimale prognoositud BGC-de arvule genoomi kohta antud kladis.Selguse huvides on viimased 15% sõlmedest ahendatud.Nooled näitavad BGC-rikkaid klade (>15 BGC), välja arvatud Mycobacterium, Gordonia (teisel kohal Rhodococcuse järel) ja Crocosphaera (teisel kohal Synechococcus'e järel).d, tundmatu c.Eremiobacterota näitas suurimat biosünteesi mitmekesisust (Shannoni indeks loodusliku tootetüübi alusel).Iga riba esindab genoomi, millel on liigis kõige rohkem BGC-sid.T1PKS, PKS tüüp I, T2/3PKS, PKS tüüp II ja tüüp III.
Lisaks rikkusele ja uudsusele uurime mere mikrobioomi biosünteesipotentsiaali biogeograafilist struktuuri.Proovide rühmitamine keskmise metagenoomilise GCF koopiate arvu jaotuse järgi (meetodid) näitas, et madala laiuskraadiga, pinnapealsed, prokarüootide rikkad ja viirusevaesed kooslused, mis pärinevad peamiselt pinnapealsetest või sügavamatest päikesevalgusega vetest, olid rikkad RiPP ja BGC terpeenide poolest.Seevastu polaarsed, süvamere-, viirus- ja osakesterikkad kooslused olid seotud NRPS ja PKS BGC suurema arvukusega (laiendatud andmed, joonis 4 ja lisateave).Lõpuks leidsime, et hästi uuritud troopilised ja pelaagilised kogukonnad on uute terpeenide kõige lootustandvamad allikad (lisaandmete joonis).Suurim potentsiaal PKS, RiPP ja muude loodustoodete jaoks (joonis 5a koos laiendatud andmetega).
Täiendamaks oma uuringut mere mikrobioomide biosünteetilise potentsiaali kohta, püüdsime kaardistada nende fülogeneetilise leviku ja tuvastada uued BGC-ga rikastatud klaad.Sel eesmärgil paigutasime meremikroobide genoomid normaliseeritud GTDB13 bakteriaalsesse ja arheaalsesse fülogeneetilisesse puusse ja katsime nende kodeeritud oletatavate biosünteesiradadega (joonis 2c).Oleme hõlpsasti tuvastanud mitmeid BGC-ga rikastatud klade (mida esindab üle 15 BGC) mereveeproovides (meetodites), mis on tuntud oma biosünteesipotentsiaali poolest, nagu tsüanobakterid (Synechococcus) ja Proteuse bakterid, nagu Tistrella32,33, või pälvinud hiljuti tähelepanu nende tõttu. looduslikud tooted.nagu Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus ja Planctomycetota34,35,36.Huvitaval kombel leidsime nendest klaadidest mitu varem uurimata liini.Näiteks need liigid, millel on rikkaim biosünteetiline potentsiaal füla Planctomycetota ja Myxococcota puhul, kuulusid vastavalt iseloomustamata kandidaatide järjekordadesse ja perekondadesse (täiendav tabel 3).Kokkuvõttes viitab see sellele, et OMD pakub juurdepääsu varem tundmatule fülogeneetilisele teabele, sealhulgas mikroorganismidele, mis võivad olla ensüümide ja looduslike toodete avastamise uued sihtmärgid.
Järgmisena iseloomustasime BGC-ga rikastatud klade mitte ainult selle liikmete poolt kodeeritud BGC-de maksimaalse arvu loendamisega, vaid ka nende BGC-de mitmekesisuse hindamisega, mis selgitab erinevat tüüpi looduslike kandidaattoodete esinemissagedust (joonis 2c ja meetodid). )..Leidsime, et selles uuringus esindasid biosünteetiliselt kõige mitmekesisemaid liike spetsiaalselt konstrueeritud bakteriaalsete MAG-idega.Need bakterid kuuluvad kasvatamata perekonda Candidatus Eremiobacterota, mis jääb suures osas uurimata, välja arvatud mõned genoomiuuringud 37, 38.Tähelepanuväärne on, et “ca.Perekonda Eremiobacterota on analüüsitud ainult maismaakeskkonnas39 ja teadaolevalt ei sisalda see ühtegi BGC-ga rikastatud liiget.Siin oleme rekonstrueerinud kaheksa sama liigi MAG-i (nukleotiidide identsus > 99%) 23. Seetõttu pakume välja liiginime "Candidatus Eudoremicrobium malaspinii", mis on saanud nime nereiidi (merenümfi) järgi, mis on kreeka mütoloogias ja ekspeditsioonides kaunis kingitus.'Ka.Vastavalt fülogeneetilisele annotatsioonile 13 ei ole E. malaspinii'l varem teadaolevaid sugulasi allpool järjestuse taset ja seega kuulub ta uude bakterite perekonda, mille kohta pakume välja „Ca.E. malaspinii” tüübiliigina ja „Ca.Eudormicrobiaceae” ametliku nimetusena (täiendav teave).Ca lühike metagenoomiline rekonstrueerimine.E. malaspinii genoomiprojekt valideeriti väga väikese sisendi, pika lugemisega metagenoomilise järjestuse ja ühe proovi (meetodid) sihipärase kokkupanekuga ühe 9,63 Mb lineaarse kromosoomina 75 kb dubleerimisega.ainsa järelejäänud ebaselgusena.
Selle liigi fülogeneetilise konteksti kindlakstegemiseks otsisime sihipärase genoomi rekonstrueerimise kaudu Tara ookeani ekspeditsiooni täiendavates eukarüootidega rikastatud metagenoomilistes proovides 40 lähedalt seotud liiki.Lühidalt, oleme sidunud metagenoomilised lugemised genoomsete fragmentidega, mis on seotud "Ca.E. malaspinii” ja oletas, et suurenenud värbamismäär selles valimis näitab teiste sugulaste olemasolu (meetodid).Selle tulemusena leidsime 10 MAG-i, 19 MAG-i kombinatsiooni, mis esindavad viit liiki kolmes perekonnas uues määratletud perekonnas (st "Ca. Eudormicrobiaceae").Pärast käsitsi kontrollimist ja kvaliteedikontrolli (laiendatud andmed, joonis 6 ja lisateave) leidsime, et „Ca.Eudormicrobiaceae liikidel on suuremad genoomid (8 Mb) ja rikkalikum biosünteetiline potentsiaal (14–22 BGC liigi kohta) kui teistel "Ca" liikmetel.Clade Eremiobacterota (kuni 7 BGC) (joonis 3a–c).
a, viie 'Ca' fülogeneetilised positsioonid.Eudormicrobiaceae liigid näitasid selles uuringus tuvastatud mereliinidele spetsiifilist BGC rikkust.Fülogeneetiline puu sisaldab kõiki 'Ca.Evolutsioonilise tausta jaoks (meetodid) kasutati MAG Eremiobacterota ja teiste sugukondade liikmeid (sulgudes genoominumbrid), mis on esitatud GTDB-s (versioon 89).Kõige välimised kihid esindavad klassifikatsioone perekonna tasemel (Ca. Eudormicrobiaceae ja Ca. Xenobiaceae) ja klassi tasemel (Ca. Eremiobacteria).Selles uuringus kirjeldatud viit liiki esindavad tähtnumbrilised koodid ja pakutud binoomnimed (täiendav teave).b, okei.Eudormicrobiaceae liikidel on seitse ühist BGC tuuma.BGC puudumine A2-klaadis oli tingitud tüüpilise MAG-i mittetäielikkusest (täiendav tabel 3).BGC-d on spetsiifilised "Ca.Amphithomicrobium” ja „Ca.Amphithomicrobium” (klassid A ja B) ei ole näidatud.c, kõik BGC-d, mis on kodeeritud kui "Ca.Leiti, et Eudoremicrobium taraoceanii ekspresseerub 623 metatranskriptoomis, mis on võetud Tara ookeanidest.Tahked ringid näitavad aktiivset transkriptsiooni.Oranžid ringid tähistavad log2-transformeeritud voldimuutusi majapidamisgeeni ekspressioonikiiruse all ja kõrgemal (meetodid).d, suhtelise arvukuse kõverad (meetodid), mis näitavad 'Ca.Eudormicrobiaceae liigid on levinud enamikus ookeanibasseinides ja kogu veesambas (pinnast kuni vähemalt 4000 m sügavuseni).Nende hinnangute põhjal leidsime, et 'Ca.E. malaspinii' moodustab süvamere pelaagiliste teradega seotud koosluste prokarüootsetest rakkudest kuni 6%.Arvasime, et liik esineb kohas, kui see leiti antud sügavuse kihi suurusest mis tahes osast.IO – India ookean, NAO – Atlandi ookeani põhjaosa, NPO – Vaikse ookeani põhjaosa, RS – Punane meri, SAO – Atlandi ookeani lõunaosa, SO – Ookeani lõunaosa, SPO – Vaikse ookeani lõunaosa.
Ca arvukuse ja leviku uurimine.Eudormicrobiaceae, mis, nagu leidsime, domineerib enamikus ookeanibasseinides ja ka kogu veesambas (joonis 3d).Kohalikult moodustavad nad 6% mere mikroobide kogukonnast, muutes nad ülemaailmse mere mikrobioomi oluliseks osaks.Lisaks leidsime Ca suhtelise sisalduse.Eudormicrobiaceae liigid ja nende BGC ekspressioonitasemed olid kõrgeimad eukarüootses rikastatud fraktsioonis (joonis 3c ja laiendatud andmed, joonis 7), mis viitab võimalikule koostoimele tahkete osakeste, sealhulgas planktoniga.See tähelepanek sarnaneb mõnevõrra 'Ca.Eudoremicrobium BGC-d, mis toodavad tsütotoksilisi looduslikke tooteid teadaolevate radade kaudu, võivad avaldada röövellikku käitumist (täiendav teave ja laiendatud andmed, joonis 8), sarnaselt teiste kiskjatega, kes toodavad spetsiifiliselt metaboliite, nagu Myxococcus41.Ca avastamine.Eudormicrobiaceae vähem kättesaadavates (süvaookeani) või eukarüootsetes proovides, mitte prokarüootsetes proovides, võib selgitada, miks need bakterid ja nende ootamatu BGC mitmekesisus jäävad looduslike toiduuuringute kontekstis ebaselgeks.
Lõppkokkuvõttes püüdsime eksperimentaalselt kinnitada meie mikrobioomipõhise töö lubadust uute radade, ensüümide ja looduslike toodete avastamisel.Erinevate BGC-de klasside hulgas on teada, et RiPP rada kodeerib rikkalikku keemilist ja funktsionaalset mitmekesisust, mis on tingitud küpsete ensüümide tuumapeptiidi mitmesugustest translatsioonijärgsetest modifikatsioonidest42.Nii et me valisime kaks 'Ca.Eudoremicrobium' RiPP BGC-d (joonised 3b ja 4a–e) põhinevad samadel, mis mis tahes teadaolevatel BGC-del (\(\bar{d}\)MIBiG ja \(\bar{d}\)RefSeq üle 0,2) .
a–c, süvamere Ca liikide jaoks spetsiifilise RiPP biosünteesi uudse (\(\bar{d}\) RefSeq = 0,29) klastri in vitro heteroloogiline ekspressioon ja in vitro ensümaatilised testid.E. malaspinii” viis difosforüülitud toodete tootmiseni.c, modifikatsioonid, mis tuvastati kõrge eraldusvõimega (HR) MS/MS (killustumine keemilises struktuuris tähistatud b ja y ioonidega) ja NMR (laiendatud andmed, joonis 9) abil.d, sellel fosforüülitud peptiidil on imetajate neutrofiilide elastaasi madal mikromolaarne inhibeerimine, mida kontrollpeptiidis ja dehüdreerivas peptiidis ei leidu (keemilisest eemaldamisest põhjustatud dehüdratsioon).Katset korrati kolm korda sarnaste tulemustega.Näiteks valguse biosünteesi teise uudse \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) klastri heteroloogne ekspressioon selgitab nelja küpse ensüümi funktsiooni, mis modifitseerivad 46 aminohappest koosnevat tuumpeptiidi.Jäägid värvitakse vastavalt HR-MS/MS-i, isotoopide märgistamise ja NMR analüüsi (täiendav teave) prognoositud modifikatsioonikohale.Katkendlik värvus näitab, et modifikatsioon toimub mõlemas jäägis.Joonisel on arvukate heteroloogsete konstruktsioonide kogum, mis näitab kõigi samas tuumas olevate küpsete ensüümide aktiivsust.h, NMR-i andmete illustratsioon amiidi karkassi N-metüülimiseks.Täielikud tulemused on näidatud joonisel fig.10 laiendatud andmetega.i, küpse FkbM valguklastri ensüümi fülogeneetiline asukoht kõigi MIBiG 2.0 andmebaasis leitud FkbM domeenide seas näitab selle perekonna N-metüültransferaasi aktiivsusega ensüümi (täiendav teave).Näidatud on BGC-de (a, e), prekursorpeptiidide struktuuride (b, f) ja looduslike saaduste oletatavate keemiliste struktuuride (c, g) skemaatilised diagrammid.
Esimene RiPP rada (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) leiti ainult süvamereliikidel „Ca.E. malaspinii” ja peptiidi-prekursori koodid (joonis 4a, b).Selles küpses ensüümis oleme tuvastanud ühe funktsionaalse domeeni, mis on homoloogne lantipeptiidi süntaasi dehüdratsioonidomeeniga, mis tavaliselt katalüüsib fosforüülimist ja sellele järgnevat 43 eemaldamist (täiendav teave).Seetõttu ennustame, et prekursorpeptiidi modifitseerimine hõlmab sellist kaheastmelist dehüdratsiooni.Kuid kasutades tandem-massispektromeetriat (MS/MS) ja tuumamagnetresonantsspektroskoopiat (NMR), tuvastasime polüfosforüülitud lineaarse peptiidi (joonis 4c).Kuigi see oli ootamatu, leidsime mitu tõendusmaterjali, mis toetavad selle lõpptooteks olemist: kaks erinevat heteroloogset peremeesorganismi ja dehüdratsiooni puudumine in vitro testides, küpse ensüümi katalüütilises dehüdratsioonikohas muteerunud võtmejääkide tuvastamine.kõik rekonstrueeris "Ca".E. malaspinii genoom (laiendatud andmed, joonis 9 ja lisateave) ja lõpuks fosforüülitud produkti bioloogiline aktiivsus, kuid mitte keemiliselt sünteesitud dehüdreeritud vorm (joonis 4d).Tegelikult avastasime, et sellel on madal mikromolaarne proteaasi inhibeeriv toime neutrofiilide elastaasi suhtes, mis on võrreldav teiste sarnaste looduslike toodetega kontsentratsioonivahemikus (IC50 = 14,3 μM) 44 , hoolimata asjaolust, et ökoloogiline roll tuleb veel välja selgitada.Nende tulemuste põhjal teeme ettepaneku nimetada rada "fosfeptiin".
Teine juhtum on keeruline RiPP rada, mis on spetsiifiline Ca.Prognoositi, et perekond Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) kodeerib looduslikke valguprodukte (joonis 4e).Need rajad pakuvad erilist biotehnoloogilist huvi, kuna suhteliselt lühikeste BGC-de poolt kodeeritud ensüümide poolt tekitatud ebatavaliste keemiliste modifikatsioonide eeldatav tihedus ja mitmekesisus on .Leidsime, et see valk erineb varem iseloomustatud valkudest selle poolest, et sellel puudub nii polütseramiidide peamine NX5N-motiiv kui ka landornamiidide lantioniini silmus46.Tavaliste heteroloogsete ekspressioonimustrite piirangute ületamiseks kasutasime neid koos kohandatud Microvirgula aerodenitrificansi süsteemiga nelja küpse raja ensüümi (meetodi) iseloomustamiseks.MS/MS, isotoopmärgistuse ja NMR kombinatsiooni kasutades tuvastasime need küpsed ensüümid peptiidi 46 aminohappelisest tuumast (joonis 4f, g, laiendatud andmed, joonised 10–12 ja lisateave).Küpsetest ensüümidest iseloomustasime FkbM O-metüültransferaasi perekonnaliikme 47 esimest ilmumist RiPP rajale ja leidsime ootamatult, et see küps ensüüm viib karkassi N-metüülimiseni (joonis 4h, i ja lisateave).Kuigi see modifikatsioon on teada looduslikes NRP48 toodetes, on amiidsidemete ensümaatiline N-metüülimine keeruline, kuid biotehnoloogiliselt oluline reaktsioon49, mis on seni huvitanud RiPP borosiinide perekonda.Spetsiifilisus 50,51.Selle aktiivsuse tuvastamine teistes ensüümide ja RiPP perekondades võib avada uusi rakendusi ja laiendada valkude funktsionaalset mitmekesisust 52 ja nende keemilist mitmekesisust.Tuginedes tuvastatud modifikatsioonidele ja kavandatava tootestruktuuri ebatavalisele pikkusele, pakume välja rajanime "pütonamiid".
Ootamatu ensümoloogia avastamine funktsionaalselt iseloomustatud ensüümide perekonnas illustreerib keskkonnagenoomika lubadust uute avastuste jaoks ning illustreerib ka piiratud võimet teha funktsionaalseid järeldusi, mis põhinevad ainult järjestuse homoloogial.Seega näitavad meie tulemused koos mittekanooniliste bioaktiivsete polüfosforüülitud RiPP-de aruannetega ressursimahukat, kuid kriitilist väärtust sünteetilise bioloogia jõupingutuste jaoks, et avastada täielikult biokeemiliste ühendite funktsionaalne rikkus, mitmekesisus ja ebatavalised struktuurid.
Siin demonstreerime mikroobide poolt kodeeritud biosünteesipotentsiaali ulatust ja nende genoomset konteksti globaalses meremikrobioomis, hõlbustades tulevasi uuringuid, tehes saadud ressursi teadusringkondadele kättesaadavaks (//microbiomics.io/ocean/).Leidsime, et suure osa selle filogeneetilisest ja funktsionaalsest uudsusest on võimalik saada ainult MAG-de ja SAG-de rekonstrueerimisega, eriti vähekasutatud mikroobide kogukondades, mis võiksid suunata tulevasi bioprospekti jõupingutusi.Kuigi me keskendume siin "Ca.Eudormicrobiaceae” kui sugupuu, mis on eriti biosünteetiliselt „andekas”, paljud avastamata mikrobiootas ennustatud BGC-d kodeerivad tõenäoliselt varem kirjeldamata ensümoloogiaid, mis annavad keskkonna- ja/või biotehnoloogiliselt olulise toimega ühendeid.
Kaasati metagenoomilised andmekogumid suurematest okeanograafilistest ja aegridade uuringutest, millel on piisav järjestussügavus, et maksimeerida ülemaailmsete mere mikroobikoosluste katvust ookeanibasseinides, sügavates kihtides ja aja jooksul.Need andmekogumid (täiendav tabel 1 ja joonis 1) hõlmavad Tara ookeanidest kogutud proovide metagenoomikat (viirusrikas, n = 190; prokarüootne rikastatud, n = 180) 12, 22 ja BioGEOTRACESi ekspeditsioonist (n = 480).Hawaii ookeani aegrida (HOT, n = 68), Bermuda-Atlandi ajaseeria (BATS, n = 62)21 ja Malaspina ekspeditsioon (n = 58)23.Kõikide metagenoomiliste fragmentide järjestuslugemised filtreeriti kvaliteedi tagamiseks BBMapi (v.38.71) abil, eemaldades lugemistest sekveneerimisadapterid, eemaldades kvaliteedikontrolli järjestustele kaardistatud lugemised (PhiX genoomid) ja kasutades trimq=14, maq=20, jätab halva lugemiskvaliteedi, maxns = 0 ja minlength = 45. Järgnevad analüüsid viidi läbi või liideti QC lugemistega, kui see oli täpsustatud (bbmerge.sh minoverlap = 16).QC näidud normaliseeriti (bbnorm.sh sihtmärk = 40, minddepth = 0) enne koostamist metaSPAde abil (vajadusel v.3.11.1 või v.3.12)53.Saadud karkassi kontiigid (edaspidi nimetatud karkassid) filtreeriti lõpuks pikkuse järgi (≥1 kb).
1038 metagenoomset proovi jagati rühmadesse ja iga proovirühma puhul sobitati kõigi proovide metagenoomilised kvaliteedikontrolli näidud iga proovi sulgudega eraldi, mille tulemuseks oli järgmine arv paarikaupa sulgudes olevaid rühmanäiteid: Tara Marine Viruses – Enriched (190×190), Prokarüootidega rikastatud (180×180), BioGEOTRACES, HOT and BATS (610×610) ja Malaspina (58×58).Kaardistamine viidi läbi Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 abil, mis võimaldab näidud sekundaarsete saitidega sobitada (kasutades lippu -a).Joondused filtreeriti nii, et need oleksid vähemalt 45 aluse pikkused, identsed ≥97% ja vahemik ≥80%.Saadud BAM-faile töödeldi, kasutades skripti jgi_summarize_bam_contig_depths for MetaBAT2 (v.2.12.1)55, et pakkuda igale rühmale sise- ja proovidevahelist katvust.Lõpuks rühmitati sulud tundlikkuse suurendamiseks, käivitades eraldi MetaBAT2 kõigis proovides, millel on –minContig 2000 ja –maxEdges 500. Me kasutame ansamblibokseri asemel MetaBAT2, kuna sõltumatud testid on näidanud, et see on kõige tõhusam üksikbokser.ja 10–50 korda kiirem kui teised tavaliselt kasutatavad poksijad57.Arvukuse korrelatsioonide mõju testimiseks kasutas juhuslikult valitud metagenoomika alamvalim (10 kahe Tara Oceani andmekogumi jaoks, 10 BioGEOTRACESi jaoks, 5 iga aegrea jaoks ja 5 Malaspina jaoks) lisaks ainult proove.Sisemised proovid rühmitatakse katvuse teabe saamiseks.(Lisainformatsioon).
Järgnevasse analüüsi kaasati täiendavad (välised) genoomid, nimelt 830 käsitsi valitud MAG-i Tara Oceans26 andmestiku alamhulgast, 5287 SAG-i andmestikust GORG20 ja andmed MAR-i andmebaasist (MarDB v. 4) 1707 eraldatud REF-ist ja 682 SAG-i) 27. MarDB andmestiku jaoks valitakse genoomid saadaolevate metaandmete põhjal, kui valimi tüüp vastab järgmisele regulaaravaldisele: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] isoleeritud'.
Iga metagenoomilise konteineri ja väliste genoomide kvaliteeti hinnati CheckM (v.1.0.13) ja Anvi'o Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59 abil.Kui CheckM või Anvi'o teatab ≥50% täielikkusest/täielikkusest ja ≤10% saastumisest/liiasusest, salvestage metagenoomilised rakud ja välisgenoomid hilisemaks analüüsiks.Need skoorid kombineeriti seejärel keskmiseks täielikuks (mcpl) ja keskmiseks saastumiseks (mctn), et klassifitseerida genoomi kvaliteet vastavalt kogukonna kriteeriumidele60 järgmiselt: kõrge kvaliteet: mcpl ≥ 90% ja mctn ≤ 5%;hea kvaliteet: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, keskmine kvaliteet: mcpl ≥ 50% ja mctn ≤ 10%, õiglane kvaliteet: mcpl ≤ 90% või mctn ≥ 10%.Seejärel korreleeriti filtreeritud genoomid kvaliteediskooridega (Q ja Q') järgmiselt: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (tüve varieeruvus)/100 + 0,5 x log[N50].(rakendatud dRep61-s).
Erinevate andmeallikate ja genoomitüüpide (MAG, SAG ja REF) võrdleva analüüsi võimaldamiseks tühistati 34 799 genoomi viitamine kogu genoomi hõlmava keskmise nukleotiidide identiteedi (ANI) põhjal, kasutades dRep-i (v.2.5.4).Kordub)61 95% ANI lävedega 28, 62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0,95 -nc 0,2) ja ühe koopia markergeenid, mis kasutavad SpecI63, mis tagab genoomi klastrite liigi tasandil.Iga dRep klastri jaoks valiti esinduslik genoom vastavalt ülalmääratletud maksimaalsele kvaliteediskoorile (Q'), mida peeti liigi tüüpiliseks.
Kaardistamise kiiruse hindamiseks kasutati BWA-d (v.0.7.17-r1188, -a), et kaardistada kõik 1038 metagenoomilise lugemise komplekti OMD-s sisalduva 34 799 genoomiga.Kvaliteediga kontrollitud lugemised kaardistati ühe otsaga režiimis ja saadud joondused filtreeriti, et säilitada ainult ≥45 bp pikkused joondused.ja identsus ≥95%.Iga proovi kuvasuhe on pärast filtreerimist järelejäänud näitude protsent jagatud kvaliteedikontrolli näitude koguarvuga.Sama lähenemisviisi kasutades vähendati igaüks 1038 metagenoomist 5 miljoni insertini (laiendatud andmed, joonis 1c) ja sobitati GORG SAG-iga OMD-s ja kõigis GEM16-s.Mereveest kogutud MAG-ide kogus GEM16 kataloogis määrati metagenoomiliste allikate märksõnapäringutega, valides mereveeproove (nt erinevalt meresetetest).Täpsemalt valime „ökosüsteemi_kategooriaks“ „veekeskkonna“, „ökosüsteemi_tüübiks“ „mere“ ja filtreerime „elupaiga“ kui „süvaookean“, „meri“, „mere-ookean“, „pelaagiline mere“, „merevesi“, “Ookean”, “Merevesi”, “Pindav merevesi”, “Pinnane merevesi”.Selle tulemuseks oli 5903 MAG-i (734 kõrge kvaliteediga), mis jaotati 1823 OTU-le (vaateid siit).
Prokarüootsed genoomid märgistati taksonoomiliselt, kasutades GTDB-Tk (v.1.0.2)64 vaikeparameetritega, mis olid suunatud GTDB r89 versioonile 13. Anvi'o abil tuvastati eukarüootsed genoomid, mis põhinesid domeeni prognoosimisel ja tagasikutsumisel ≥50% ja koondamisel ≤ 10%.Liigi taksonoomiline annotatsioon on määratletud kui üks selle tüüpilistest genoomidest.Välja arvatud eukarüootid (148 MAG), märgiti iga genoom esmalt funktsionaalselt, kasutades prokka (v.1.14.5)65, nimetades täielikud geenid, defineerides vastavalt vajadusele "arhea" või "bakteri" parameetrid, mida on kirjeldatud ka mitte- kodeerivad geenid.ja CRISPR piirkonnad, teiste genoomiliste tunnuste hulgas.Märkige ennustatud geenid, tuvastades universaalsed ühekoopialised markergeenid (uscMG), kasutades fetchMG (v.1.2)66, määrake ortoloogirühmad ja tehke päring, kasutades munaNOG-l (v.5.0)68 põhinevat emapperit (v.2.0.1)67.KEGG andmebaas (avaldatud 10. veebruaril 2020) 69. Viimane samm viidi läbi, sobitades valgud KEGG andmebaasiga, kasutades DIAMOND (v.0.9.30)70 päringu ja teema katvus ≥70%.Tulemused filtreeriti täiendavalt vastavalt NCBI prokarüootse genoomi annotatsioonitorustikule71, mis põhines bitikiirusel ≥ 50% maksimaalsest eeldatavast bitikiirusest (link ise).Geenijärjestusi kasutati sisendina ka BGC-de tuvastamiseks genoomis, kasutades antiSMASH (v.5.1.0)72 vaikeparameetrite ja erinevate klastri plahvatustega.Kõik genoomid ja annotatsioonid on koostatud OMD-sse koos veebis saadaolevate kontekstipõhiste metaandmetega (//microbiomics.io/ocean/).
Sarnaselt eelnevalt kirjeldatud meetoditele12,22 kasutasime CD-HIT-i (v.4.8.1), et koondada >56,6 miljonit valku kodeerivat geeni bakteriaalsetest ja arheoloogilistest genoomidest OMD-st 95% identsusteks ja lühemateks geenideks (90% katvus)73 kuni >17,7 miljonit geeniklastrit.Iga geeniklastri esindusgeeniks valiti pikim järjestus.Seejärel sobitati 1038 metagenoomi> 17,7 miljoni BWA (-a) klastri liikmega ja saadud BAM-failid filtreeriti, et säilitada ainult joondused ≥95% identsusega ja ≥45 baasjoondusega.Pikkusega normaliseeritud geenide arvukus arvutati, loendades esmalt sisestused parimast unikaalsest joondusest ja seejärel fuzzy-kaardistatud insertide jaoks, lisades vastavatele sihtgeenidele fraktsioonilised loendused, mis on proportsionaalsed nende ainulaadsete sisestuste arvuga.
Laiendatud OMD genoomid (koos täiendavate MAG-idega firmalt Ca. Eudormicrobiaceae, vt allpool) lisati mOTUs74 metagenoomilise analüüsi tööriista andmebaasi (v.2.5.1), et luua laiendatud mOTU võrdlusandmebaas.Kümnest uscMG-st jäi ellu vaid kuus ühekoopialist genoomi (23 528 genoomi).Andmebaasi laiendamise tulemusena tekkis liigi tasandil 4494 täiendavat klastrit.1038 metagenoomi analüüsiti mOTU vaikeparameetrite (v.2) abil.Kokku 989 genoomi, mis sisaldusid 644 mOTU klastris (95% REF, 5% SAG ja 99,9% kuuluvad MarDB-sse), ei tuvastatud mOTU profiiliga.See peegeldab erinevaid täiendavaid MarDB genoomide mereisolatsiooni allikaid (enamik avastamata genoome on seotud setetest eraldatud organismidega, mereperemeestega jne).Selles uuringus avatud ookeani keskkonnale keskendumise jätkamiseks jätsime need allavoolu analüüsist välja, välja arvatud juhul, kui neid tuvastati või kaasati selles uuringus loodud laiendatud mOTU andmebaasi.
Kõik MAG-i, SAG-i ja REF-i BGC-d OMD-s (vt ülal) kombineeriti kõigis metagenoomilistes karkassides tuvastatud BGC-dega (antiSMASH v.5.0, vaikeparameetrid) ja iseloomustati kasutades BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM-domeen)75.Nende funktsioonide põhjal arvutasime kõik koosinuskaugused BGC-de vahel ja rühmitasime need (keskmised lingid) GCF-i ja GCC-ks, kasutades kauguslävesid vastavalt 0,2 ja 0,8.Need läved on kohandatud künnistest, mida varem kasutati Eukleidilise kauguse75 abil koos koosinuskaugusega, mis leevendab mõnda viga esialgses BiG-SLICE klastrite strateegias (täiendav teave).
Seejärel filtreeriti BGC-d, et säilitada ainult ≥5 kb karkassidel kodeeritud, et vähendada killustumise ohtu, nagu eelnevalt kirjeldatud16, ja välistada MarDB REF-id ja SAG-id, mida 1038 metagenoomis ei leitud (vt ülal).Selle tulemusel kodeeris OMD genoom kokku 39 055 BGC-d, lisaks 14 106 tuvastati metagenoomilistel fragmentidel (st neid ei kombineeritud MAG-ideks).Neid "metagenoomilisi" BGC-sid kasutati mere mikrobioomi biosünteesi potentsiaali osakaalu hindamiseks, mida andmebaasi ei salvestatud (täiendav teave).Iga BGC-d iseloomustati funktsionaalselt vastavalt ennustatavatele tootetüüpidele, mis on määratletud anti-SMASH või jämedamate tootekategooriatega, mis on määratletud BiG-SCAPE76-s.Et vältida proovide võtmise kõrvalekaldeid kvantifitseerimisel (GCC/GCF taksonoomiline ja funktsionaalne koostis, GCF ja GCC kaugus võrdlusandmebaasidest ning GCF metagenoomne arvukus), säilitades iga liigi GCF kohta ainult pikima BGC, eemaldati 39 055 BGC-d veelgi, kokku 17 689 BGC.
GCC ja GCF uudsust hinnati arvutatud andmebaasi (RefSeq andmebaasi BiG-FAM)29 ja eksperimentaalselt kontrollitud (MIBIG 2.0)30 BGC vahelise kauguse põhjal.Iga 17 689 tüüpilise BGC jaoks valisime vastava andmebaasi väikseima koosinuskauguse.Seejärel need minimaalsed vahemaad keskmistatakse (keskmised) vastavalt GCF-i või GCC-le.GCF loetakse uueks, kui kaugus andmebaasist on suurem kui 0,2, mis vastab (keskmise) GCF ja etalonide ideaalsele kaugusele.GCC jaoks valime linkidega pikaajalise suhte lukustamiseks väärtuse 0,4, mis on kaks korda suurem kui GCF-i määratud lävi.
BGC metagenoomilist arvukust hinnati selle biosünteetiliste geenide keskmise arvukusena (määratud anti-SMASH-ga), mis on saadaval geenitaseme profiilidest.Seejärel arvutati iga GCF või GCC metagenoomne arvukus tüüpiliste BGC-de summana (17 689-st).Seejärel normaliseeriti need arvukuse kaardid rakulise koostise jaoks, kasutades proovi kohta mOTU arvu, mis arvestas ka järjestamise jõupingutusi (laiendatud andmed, joonis 1d).GCF või GCC levimus arvutati proovide protsendina, mille arvukus oli> 0.
Eukleidiline kaugus proovide vahel arvutati normaliseeritud GCF profiili põhjal.Neid vahemaid vähendati UMAP77 abil ja saadud manuseid kasutati HDBSCAN78 abil järelevalveta tihedusepõhiseks klastriteks.HDBSCAN-i kasutatav klastri optimaalne minimaalne punktide arv (ja seega ka klastrite arv) määratakse klastri liikmelisuse kumulatiivse tõenäosuse maksimeerimise teel.Tuvastatud klastreid (ja nende klastrite juhuslikku tasakaalustatud alamvalimi, et võtta arvesse kõrvalekaldeid permutatsioonilises mitmemõõtmelises dispersioonanalüüsis (PERMANOVA)) testiti PERMANOVA abil olulisust vähendamata eukleidiliste kauguste suhtes.Proovide keskmine genoomi suurus arvutati mOTU suhtelise arvukuse ja genoomide liikmete hinnangulise genoomi suuruse põhjal.Eelkõige hinnati iga mOTU keskmist genoomi suurust selle liikmete genoomi suuruse keskmisena, mida on korrigeeritud täielikkuse suhtes (pärast filtreerimist) (näiteks 75% täieliku genoomi pikkusega 3 Mb on kohandatud suurus 4 Mb).keskmiste genoomide puhul, mille terviklikkus on ≥70%.Seejärel arvutati iga proovi keskmine genoomi suurus suhtelise arvukusega kaalutud mOTU genoomi suuruste summana.
Genoomiga kodeeritud BGC-de filtreeritud komplekt OMD-s on näidatud bakteriaalsetes ja arheaalsetes GTDB-puudes (≥5 kb raamistikes, välja arvatud REF ja SAG MarDB, mida ei leitud 1038 metagenoomist, vt ülal) ja nende prognoositud tootekategooriad fülogeneetilise põhjal. genoomi asukoht (vt eespool).Esmalt vähendasime andmeid liikide kaupa, kasutades esinduslikuna selle liigi genoomi, millel on kõige rohkem BGC-sid.Visualiseerimiseks jagati esindajad veel puurühmadesse ja jällegi valiti iga rakulise klaadi jaoks esindajaks kõige rohkem BGC-sid sisaldav genoom.BGC-ga rikastatud liike (vähemalt üks >15 BGC-ga genoom) analüüsiti täiendavalt, arvutades nendes BGC-des kodeeritud tootetüüpide jaoks Shannoni mitmekesisuse indeksi.Kui kõik prognoositavad tootetüübid on samad, loetakse keemilised hübriidid ja muud komplekssed BGC-d (nagu anti-SMAH ennustas) kuuluvaks samasse tootetüüpi, olenemata nende järjestusest klastris (nt valgu-bakteriotsiini ja bakteriotsiini-proteoproteiini fusioon keha).hübriid).
Ülejäänud DNA (hinnanguliselt 6 ng) Malaspina proovist MP1648, mis vastab bioloogilisele proovile SAMN05421555 ja sobib Illumina SRR3962772 metagenoomilise lugemiskomplektiga lühilugemiseks, töödeldud PacBio sekveneerimisprotokolli järgi ülimadala sisendiga, et kasutada Pacbellifikatsiooni komplekti Pacbellamplification komplekt (100-980-000) ja SMRTbell Express 2.0 malli ettevalmistamise komplekt (100-938-900).Lühidalt, järelejäänud DNA lõigati, parandati ja puhastati (ProNexi helmed), kasutades Covarist (g-TUBE, 52104).Puhastatud DNA allutatakse seejärel raamatukogu ettevalmistamisele, amplifitseerimisele, puhastamisele (ProNex beads) ja suuruse valimisele (>6 kb, Blue Pippin) enne viimast puhastamisetappi (ProNex beads) ja sekveneerimist Sequel II platvormil.
Kahe esimese rekonstrueerimine ca.MAG Eremiobacterota puhul tuvastasime kuus täiendavat ANI-d> 99% (need on toodud joonisel 3), mis algselt filtreeriti saastumise skooride põhjal (hiljem tuvastati geenide dubleerimisena, vt allpool).Leidsime ka kandiku, millel on silt “Ca”.Eremiobacterota” erinevatest uuringutest23 ja kasutas neid koos kaheksa meie uuringust pärit MAG-ga võrdlusmaterjalina 633 eukarüootse rikastatud (>0,8 µm) proovi metagenoomilise lugemise jaoks, kasutades allaproovide võtmiseks BWA-d (v.0.7.17) Ref -r1188, – lipp. kaardistamine (5 miljonit lugemist).Rikastusspetsiifiliste kaartide põhjal (filtreeritud 95% joondusidentiteedi ja 80% lugemise katvuse järgi) valiti kokkupanekuks 10 metagenoomi (eeldatav katvus ≥5×) ja sisu korrelatsiooni jaoks veel 49 metagenoomi (eeldatav katvus ≥1×).Kasutades samu parameetreid nagu ülal, need proovid koondati ja lisati 10 täiendavat Ca.MAG Eremiobacterota on taastatud.Need 16 MAG-i (arvestamata kahte juba andmebaasis olevat) toovad laiendatud OMD genoomide koguarvu 34 815-ni.MAG-idele määratakse taksonoomilised auastmed nende genoomse sarnasuse ja positsiooni alusel GTDB-s.18 MAG-i replitseeriti dRep abil 5 liigiks (sisene ANI > 99%) ja 3 perekonnaks (sisene ANI 85% kuni 94%) samas perekonnas79.Liikide esindajad valiti käsitsi terviklikkuse, saastumise ja N50 põhjal.Soovitatav nomenklatuur on esitatud täiendavas teabes.
Hinnake Ca terviklikkust ja saastumist.MAG Eremiobacterota, hindasime uscMG olemasolu, samuti liini- ja domeenispetsiifilisi ühe koopia markerite geenikomplekte, mida kasutasid CheckM ja Anvi'o.40 uscMG-st 2 duplikaadi tuvastamist kinnitati fülogeneetilise rekonstrueerimisega (vt allpool), et välistada võimalikku saastumist (see vastab 5% nende 40 markergeeni põhjal).Täiendav uuring viie tüüpilise MAG-i 'Ca.Nende rekonstrueeritud genoomide saasteainete madal tase kinnitati Eremiobacterota liikide puhul, kasutades interaktiivset Anvi'o liidest, mis põhineb arvukuse ja järjestuse koostise korrelatsioonidel (täiendav teave)59.
Fülogenoomilise analüüsi jaoks valisime viis tüüpilist MAG-i "Ca".Eudormicrobiaceae”, kõik liigid “Ca.Eremiobacterota ja teiste taimeliikide (sh UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria ja Planctomycetota) genoom on saadaval GTDB-st (r89)13.Kõik need genoomid märgistati, nagu eelnevalt kirjeldatud ühe koopia markergeeni ekstraheerimise ja BGC annotatsiooni jaoks.GTDB genoomid konserveeriti vastavalt ülaltoodud terviklikkuse ja saastumise kriteeriumidele.Fülogeneetiline analüüs viidi läbi Anvi'o Phylogenetics59 töövoo abil.Puu konstrueerimiseks kasutati IQTREE (v.2.0.3) (vaikevalikud ja -bb 1000)80 39 tandem ribosomaalse valgu joondusel, mille tuvastas Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81.Tema positsioone vähendati.et katta vähemalt 50% genoomist82 ja Planctomycecotat kasutati välisrühmana GTDB puu topoloogia põhjal.Üks 40 uscMG-st koosnev puu ehitati samu tööriistu ja parameetreid kasutades.
Tavaliste mikroobide tunnuste ennustamiseks kasutasime Traitarit (v.1.1.2) vaikeparameetritega (fenotüüp, nukleotiididest)83.Uurisime potentsiaalset röövellikku elustiili, tuginedes varem välja töötatud röövloomade indeksile84, mis sõltub valku kodeeriva geeni sisaldusest genoomis.Täpsemalt, me kasutame DIAMOND'i genoomis leiduvate valkude võrdlemiseks OrthoMCL andmebaasiga (v.4)85, kasutades valikuid –sensive –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 JA loendame geenid, mis vastavad kiskjate ja mittekiskjate markergeenid.Indeks on röövellike ja mitteröövlike märkide arvu erinevus.Täiendava kontrollina analüüsisime ka "Ca" genoomi.Entotheonella TSY118 tegur põhineb selle seosel Ca-ga.Eudoremicrobium (suur genoomi suurus ja biosünteetiline potentsiaal).Järgmisena testisime potentsiaalseid seoseid röövloomade ja mittekiskjate markergeenide ning Ca biosünteesi potentsiaali vahel.Eudormicrobiaceae” ja leidis, et mitte rohkem kui üks geen (mis tahes tüüpi markergeenist, st kiskja/mittekiskja geenist) kattub BGC-ga, mis viitab sellele, et BGC ei sega röövloomade signaale.Sekretsioonisüsteemi, pili ja flagella86 spetsiifiliseks uurimiseks viidi läbi segatud replikonide täiendav genoomne annotatsioon, kasutades TXSSCAN-i (v.1.0.2).
Viis tüüpilist Ca kaardistati, kaardistades 623 metatranskriptoomi Taara ookeanide prokarüootsetest ja eukarüootsetest rikastusfraktsioonidest22,40,87 (kasutades BWA-d, v.0.7.17-r1188, -a lippu).Eudormicrobiaceae genoom.BAM-faile töödeldi funktsiooniga FeatureCounts (v.2.0.1)88 pärast 80% lugemiskatvust ja 95% identiteedi filtreerimist (valikutega featureCounts –primary -O –fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) Loendab insertide arv geeni kohta.Loodud kaardid normaliseeriti geeni pikkuse ja markergeenide arvukuse mOTU (pikkusega normaliseeritud keskmine insertsioonide arv geenide puhul, mille sisestusarv on >0) ja logaritmiliselt teisendati väärtusele 22,74, et saada iga geenitaseme suhteline ekspressioon raku kohta, mis selgitab ka varieeruvus proovide vahel järjestuse määramise ajal.Sellised suhted võimaldavad võrdlevat analüüsi, leevendades koostise probleeme suhtelise arvukuse andmete kasutamisel.Edasiseks analüüsiks kaaluti ainult proove, millel oli >5 10 mOTU markergeenist, et võimaldada tuvastada piisavalt suur osa genoomist.
Ca normaliseeritud transkriptoomi profiil.E. taraoceanii mõõtmeid vähendati UMAP-i abil ja saadud kujutist kasutati ekspressiooni oleku määramiseks HDBSCAN-i abil (vt ülal) järelevalveta rühmitamiseks.PERMANOVA testib algses (mitte vähendatud) kaugusruumis tuvastatud klastrite vaheliste erinevuste olulisust.Nende seisundite vahelist diferentsiaalset ekspressiooni testiti kogu genoomis (vt ülal) ja tuvastati 201 KEGG rada 6 funktsionaalses rühmas, nimelt: BGC, sekretsioonisüsteem ja lipugeenid TXSSCANist, degradatsiooniensüümid (proteaas ja peptidaasid) ning röövloomad ja mitte. röövellikud geenid.röövellikud indeksi markerid.Iga proovi jaoks arvutasime iga klassi jaoks keskmise normaliseeritud ekspressiooni (pange tähele, et BGC ekspressioon ise arvutatakse selle BGC biosünteetiliste geenide keskmise ekspressioonina) ja testiti olulisust olekute vahel (Kruskal-Wallise test, kohandatud FDR jaoks).
Sünteetilised geenid osteti ettevõttelt GenScript ja PCR praimerid osteti ettevõttelt Microsynth.DNA amplifitseerimiseks kasutati Phusion polümeraasi firmast Thermo Fisher Scientific.DNA puhastamiseks kasutati NucleoSpin plasmiide, NucleoSpin geeli ja Macherey-Nageli PCR puhastuskomplekti.Restriktsiooniensüümid ja T4 DNA ligaas osteti ettevõttest New England Biolabs.Muud kemikaalid peale isopropüül-β-d-1-tiogalaktopüranosiidi (IPTG) (Biosynth) ja 1,4-ditiotreitooli (DTT, AppliChem) osteti firmalt Sigma-Aldrich ja neid kasutati ilma täiendava puhastamiseta.Antibiootikumid klooramfenikool (Cm), spektinomütsiindivesinikkloriid (Sm), ampitsilliin (Amp), gentamütsiin (Gt) ja karbenitsilliin (Cbn) osteti ettevõttelt AppliChem.Bacto Tryptone ja Bacto Yeast Extract söötme komponendid osteti ettevõttelt BD Biosciences.Sekveneerimiseks mõeldud trüpsiin osteti firmalt Promega.
Geenijärjestused ekstraheeriti SMASH-vastasest ennustatud BGC 75.1-st.E. malaspinii (täiendav teave).
Geenid embA (lookus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-geen_5), embM (lookus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-geen_4) ja embAM (sealhulgas geenidevahelised piirkonnad) optimeeriti E-s ilma ekspressioonita pRC5-s ja sekveneeriti (sünteetilises konstruktsioonis)7. millal.EmA geen subklooniti pACYCDuet-1 (CmR) ja pCDFDuet-1 (SmR) esimesse mitmekordsesse kloonimissaiti (MCS1) koos BamHI ja HindIII lõhustamiskohtadega.Geenid embM ja embMopt (koodoniga optimeeritud) subklooniti MCS1 pCDFDuet-1(SmR) koos BamHI ja HindIII-ga ning paigutati pCDFDuet-1(SmR) ja pRSFDuet-1(KanR) (MCS2) teise mitmekordsesse kloonimissaiti. NdeI/ChoI.EmAM-kassett subklooniti pCDFDuet1 (SmR) koos BamHI ja HindIII lõhustamiskohtadega.Orf3/embI geen (lookus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-geen_3) konstrueeriti kattuva pikendusega PCR-iga, kasutades praimereid EmbI_OE_F_NdeI ja EmbI_OE_R_XhoI, mis lõigati NdeI/XhoI-ga, kasutades restriktsiooni pCSM1 (samamoodi ligeeriti Xho1-D) ja Xho1-D. ensüümid (täiendav tabel).6).Restriktsiooniensüümidega seedimine ja ligeerimine viidi läbi vastavalt tootja protokollile (New England Biolabs).