310 10*1mm roostevabast terasest keritud torude keemiline komponent, spidroiini N-terminaalsed domeenid moodustavad amüloidfibrillidel põhinevaid hüdrogeele ja pakuvad platvormi valkude immobiliseerimiseks.

Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Kasutate piiratud CSS-i toega brauseri versiooni.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Lisaks näitame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiilide ja JavaScriptita.
Liugurid, mis näitavad kolme artiklit slaidi kohta.Kasutage slaidide vahel liikumiseks nuppu Tagasi ja Järgmine või igal slaidil liikumiseks lõpus olevaid slaidijuhtnuppe.

Spetsifikatsioon

310 10*1mm roostevabast terasest spiraaltorude tarnijad

Keemiline koostis

Mehaanilised omadused

Rekombinantsetel ämbliksiidivalkudel (ämbliksiidiproteiinidel) on palju potentsiaalseid rakendusi uute biomaterjalide väljatöötamisel, kuid nende multimodaalne ja agregatsioonile kalduvus muudab nende hankimise ja kasutamise raskeks.Siin teatame, et rekombinantsed miniatuursed spidroiinivalgud ja, mis kõige tähtsam, N-terminaalne domeen (NT) moodustavad ise kiiresti 37 ° C juures isekandvad ja läbipaistvad hüdrogeelid.NT-st ja rohelisest fluorestseeruvast valgust või puriinnukleosiidfosforülaasist koosnevad sulandvalgud moodustavad täisfunktsionaalseid sulandvalke.Hüdrogeelid.Meie tulemused näitavad, et rekombinantsed NT- ja sulandvalgud tagavad kõrge ekspressioonisaagise ja annavad hüdrogeelidele atraktiivsed omadused, nagu läbipaistvus, geelistumine ilma ristsidumiseta ja aktiivsete valkude otsene immobiliseerimine suure tihedusega.
Ämblikel on kuni seitse erinevat siidinäärmete komplekti, millest igaüks toodab teatud tüüpi siidi.Kõik seitse siidiliiki koosnevad umbes 6000 jäägipikkustest ämbliksiidivalkudest (spidroiinidest) ja sisaldavad suurt keskset korduspiirkonda, mida ümbritsevad sfäärilised N- ja C-terminaalsed domeenid (NT ja CT)1,2.Enim uuritud siiditüüpi, primaarset ampulli, toodab esmane ampullnääre.Selles näärmes sünteesib epiteelirakkude monokiht spidroiini valke ja sekreteerib need näärme valendikusse, kus need on lahustuval kujul (doping) ülikõrges kontsentratsioonis (30–50% w/v)3,4.Peamiste ampullaarsete spidroiinivalkude organisatsiooni ja konformatsiooni üle näärmes on vaieldud, kuid enamik eksperimentaalseid tõendeid viitab üldiselt spiraalse ja/või juhusliku spiraalse konformatsiooni ning mitsellaarsete või lamellstruktuuride olemasolule 5, 6, 7, 8, 9, 10.Kui korduvad domeenid reguleerivad siidikiudude mehaanilisi omadusi, moodustades β-lehe nanokristalle ja amorfseid struktuure 11, 12, 13, 14, 15, siis lõppdomeenid reguleerivad siidikiude vastusena muutuvatele tingimustele piki siidinäärmeid .Kontrollides siidi moodustumist, 19. Terminaalsed domeenid on evolutsiooniliselt konserveerunud ja nende funktsioon võib olla ühine kõikidele spidroiini valkudele 2,20,21.Nääret läbides langeb spidroiini pH ligikaudu 7,6-lt < 5,716-le ning suureneb nihke ja venitusega, mida vahendab liikumine läbi järk-järgult aheneva kanali.Lahuses on CT α-spiraalne konstitutiivne paralleeldimeer17, kuid vastusena madalale pH-le ja nihkejõududele rullub CT lahti ja vahetab β-kihte16, 17, võib-olla käivitab β-kihid Convert 16 korduvates piirkondades. NT on monomeersed all. tingimused, mis peegeldavad tingimusi näärme valendikus ja vahendavad spidroiini lahustuvust, kuid alandatud pH korral põhjustab paljude karboksüülhappe kõrvalahelate protoneerimine NT dimeriseerumist pKa väärtusega ligikaudu 6,5, stabiliseerides seeläbi NT ja fikseerides spidroiini suurtes kogustes. kogused.võrgud16,18.Seega mängib NT võtmerolli hõõgniidi moodustumisel, muutudes kattes olevast monomeerist kiu dimeeriks23,24,25.NT jääb hästi lahustuv ja spiraalne kõigis seni uuritud tingimustes 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, mis inspireeris selle arendamist lahustuvust suurendava märgisena heteroloogsete valkude tootmiseks.
Rekombinantne mini-ämbliku siidivalk, mis koosneb ühest NT-st, ühest lühikesest korduspiirkonnast, ühest CT-st ja puhastamiseks mõeldud His6-märgisest (His-NT2RepCT), lahustub vesipuhvris sama hästi kui ämbliku natiivne siidivalk ja jäljendab siidiämbliku loomulikke olulisi omadusi. .katvus 25.31.His-NT2RepCT saab kedrata pidevateks kiududeks, kasutades biomimeetilist masinat, milles pH 8 lahustuv kate ekstrudeeritakse pH 525, 32, 33, 34, 35 veevanni.His-NT2RepCT-d ekspresseeriva E. coli bioreaktori kääritamine ja sellele järgnev järeltöötlus andsid pärast puhastamist saagiseks >14 g/l.His-NT2RepCT kõrge saagis, kõrge lahustuvus ja piisav reaktsioon happelistele tingimustele on kõik tingitud NT23, 25, 34.
Siin kirjeldame läbipaistvate hüdrogeelide kiiret moodustumist rekombinantsetest spidroiinivalkudest, sealhulgas ainult NT-st, inkubeerides valgulahust 37 ° C juures.Kasutades tioflaviin T fluorestsentsi (ThT), Fourier' transformatsiooni infrapunaspektroskoopiat (FTIR), tuumamagnetresonantsspektroskoopiat (NMR) ja transmissioonelektronmikroskoopiat (TEM), leidsime, et NT ja mikroämblikuvalgud läbivad struktuurse transformatsiooni β-lehtedeks ja amüloiditaolisteks fibrillideks. kui moodustuvad geelid.Lisaks moodustavad NT ja rohelise fluorestseeruva valgu (GFP) või puriinnukleosiidfosforülaasi (PNP) sulandvalgud hüdrogeele, millel on täielikult funktsionaalsed fusioonfragmendid.Suure läbilaskevõimega ekspressioon heteroloogsetes peremeesorganismides koos hüdrogeelide kiire moodustumisega füsioloogilistes tingimustes avab võimaluse konstrueeritud funktsioonidega hüdrogeelide kulutõhusaks tootmiseks.
Erinevalt enamikust teatatud rekombinantsetest spidroiinivalkudest36 on His-NT2RepCT stabiilne Tris-HCl puhvris pH 8 juures ja seda saab kontsentreerida kuni 500 mg/ml ilma sadestamiseta25.Seetõttu olime üllatunud, kui avastasime, et see valk moodustab 37 °C juures inkubeerimisel kiiresti optiliselt selged, isekandvad hüdrogeelid (joonis 1b-d).Edasised uuringud näitasid, et His-NT2RepCT geelistumine toimus laias valgukontsentratsiooni vahemikus (10–300 mg/ml) ja see kontsentratsioon oli pöördvõrdelises korrelatsioonis geelistumisajaga (joonis 1c ja täiendav joonis 1).Et teada saada, millised His-NT2RepCT osad vahendavad hüdrogeeli moodustumist, uurisime seejärel iga domeeni eraldi ja erinevates kombinatsioonides, kasutades kolvi inversiooni testi (joonis 1a, b).Kõik rekombinantse spidroiini testitud fraktsioonid moodustasid geelid (valgukontsentratsioonil 300 mg/ml) vähem kui 1 tunniga, välja arvatud sadestunud 2Rep (joonis 1b).See viitab sellele, et NT ja CT üksi, kombinatsioonis või koos kordustega, võivad geelistada temperatuuril 37 °C ja His6 märgis ei mõjuta seda protsessi olulisel määral.Arvestades levinud arusaama, et NT on hästi lahustuv ja stabiilne valk ning et varasemad teated rekombinantsete spidroiini hüdrogeelide kohta on omistanud geelistumise mõju korduvate piirkondade ja/või CT-de konformatsioonilistele muutustele, võiks NT ise seda teha.Tarretumise avastamine oli ootamatu.Täiendav tabel 1) 37, 38, 39. Tähelepanuväärne on, et NT tarretus juba 10 minuti jooksul kontsentratsioonil ≥ 300 mg/ml (joonis 1c).Viaalide inversioonikatsed erinevate NT kontsentratsioonidega näitasid, et >50 mg/ml juures geelistub NT lahus kiiremini kui His-NT2RepCT vastavas kontsentratsioonis (mass/maht, joonis 1c).
Käesolevas töös uuritud erinevate spidroiinikonstruktsioonide skemaatiline esitus.b Erinevate rekombinantsete spidroiinivalkude (300 mg/ml) geelistumise aeg 37 °C juures, mida kontrolliti viaali ümberpööramisega.CT-geel kohe ilma inkubeerimiseta (<300 mg/mL), 2Rep sade (300 mg/ml, 5 mm skaala).c His-NT2RepCT ja NT geelistumise aeg näidatud valgukontsentratsioonidel temperatuuril 37 °C.d His-NT2RepCT ja NT hüdrogeelide fotod, mille alla on trükitud vastavalt ämblik ja täht “NT” (mõlemad 200 mg/ml, skaala riba 5 mm).
Erinevatest rekombinantsetest spidroiinivalkudest moodustunud hüdrogeelidel on veidi erinev värvus ja palja silmaga vaatlemine näitab erinevat läbipaistvusastet (joonis 1b).NT geelid on erakordselt selged, samas kui teised geelid muutuvad läbipaistmatuks.Silindrilistesse torudesse valatud His-NT2RepCT ja NT geelid saab vormist tervena eemaldada (joonis 1d).
Et testida, kas looduslikud ämbliku siidist katted geelistuvad tingimustes, mis nüüd leiti põhjustavad rekombinantsete spidroiini valkude geelistumist, koguti katted Rootsi sildämbliku (Larinioides sclopetarius) suurelt ampullnäärmelt.Kateid säilitati 20 mM Tris-HCl puhvris 50 mg / ml (mõõdetud kuivmassi põhjal), kuid 21-päevase inkubeerimise ajal temperatuuril 37 ° C ei täheldatud geelistumist (täiendav joonis 2a).
Nende geelide kvantifitseerimiseks saab geelistumisprotsessi uurimiseks ja üldiste mehaaniliste omaduste määramiseks kasutada reoloogilisi mõõtmisi.Eelkõige võib säilitusmooduli (elastsuse) jälgimine kõrgel temperatuuril anda teavet nii geelistumistemperatuuri kui ka katte viskoelastsete omaduste kohta.Temperatuuritõusu katsed (kasutades 1 °C/min 25–45 °C juures, põhinedes varasematel uuringutel, kus kasutati looduslikku siidi põhilahuseid)40,41 näitasid, et His-NT2RepCT ja NT lahuste säilitusmoodulid suurenesid temperatuuri tõustes .suurendati (joonis 2 ja täiendav joonis 3).Nimelt hakkas NT-moodul kasvama madalamal temperatuuril võrreldes His-NT2RepCT-ga, mis on kooskõlas kiirema geelistumisajaga, mida täheldati, kui NT-d inkubeeriti vahetult His-NT2RepCT-ga 37 °C juures (joonis 1).Pärast järgnevat temperatuuri langust ei taastunud säilitusmoodul madalamatele väärtustele ja jäi kaomoodulist kõrgemale (vt lisajoonis 3), mis näitab termiliselt pöördumatut stabiilset geelistumist.Pärast geelistamist oli lõplik elastsusmoodul His-NT2RepCT hüdrogeelide puhul 15–330 kPa kontsentratsioonil 100–500 mg/ml ja NT hüdrogeelide lõplik elastsusmoodul (100–500 mg/mL) vahemikus 2–1400 kPa (joonis , 2 ja täielikud rambiandmed) vt lisajoonis 3).
a Temperatuuri muutus His-NT2RepCT (300 mg/mL) ja b NT (300 mg/mL) mõõtmisel loksutamisega.Nooled näitavad temperatuuri suundumust ja salvestusmooduli andmete heledam varjutus näitab katsetamist instrumendi väiksemate pöördemomendi väärtustega, kui tootja on määranud, mis on suurenenud müra põhjuseks.c His-NT2RepCT ja NT lõppmooduli akumulatsioon pärast kõrgendatud temperatuuri (100, 300 ja 500 mg/ml).Kõik mooduli näidud võetakse sagedusega 0,1 Hz.
Potentsiaalse meetodina geelistumisega seotud konformatsiooniliste muutuste uurimiseks registreerisime His-NT2RepCT ja NT FTIR-spektrid enne ja pärast geelistamist 37 °C juures (joonis 3a, b).Nagu oodatud, vastasid His-NT2RepCT ja NT lahuste spektrid valkudele, millel oli α-heeliksi/juhusliku mähise sekundaarne struktuur, väljendunud ribaga 1645 cm-1 juures.Mõlema hüdrogeeli puhul põhjustas geelistumine kahe haru moodustumise I keskmises ribas ligikaudu 1617 cm-1 ja 1695 cm-1 juures (joonis 3a, b), mis näitab antiparalleelsete β-lehtstruktuuride moodustumist.Neid muutusi on selgelt näha ka vastavates teises tuletis- ja erinevusgeelistumisspektris (täiendav joonis 4b).NT β-kihi kaks riba olid rohkem väljendunud kui His-NT2RepCT omad, mis näitab, et β-kihi ribade kogusisaldus NT hüdrogeelis oli kõrgem kui NT2RepCT hüdrogeelil.
His-NT2RepCT ja bNT (mõlemad 500 mg/ml) FTIR-neeldumisspektrid enne (lahus) ja pärast (geel) inkubeerimist 37 °C juures.c Resuspendeeritud 50 mg/ml NT2RepCT geelide ja d NT TEM-kujutised.Skaalariba 200 nm.e His-NT2RepCT ja NT hüdrogeelide kiudude läbimõõt.n = 100 mõõdetud fibrilli, p < 0,0001.Vearibad näitavad standardhälvet.Vearibade keskpunkt on keskmine.Statistilise analüüsi jaoks kasutati paaritu t-testi (kahe sabaga).f Erinevate rekombinantsete spidroiinivalkude (100 mg/ml) ThT fluorestsents 37 °C juures ilma loksutamata.g NT (100 mg/mL) inokulatsioonikatsed 100 mg/ml NT geelist 0%, 5%, 10% ja 20% seemnetega.
Geeli analüüs transmissioonelektronmikroskoopia (TEM) abil näitas, et hüdrogeel koosneb amüloiditaolistest fibrillidest (joonised 3c, 3d).NT-st moodustunud fibrillid olid piklikud (läbimõõt 5–12 nm) ja hargnemata, samas kui His-NT2RepCT fibrillid olid lühema pikkusega ja oluliselt laiema läbimõõduga (7–16 nm) (joonis 3e).Need tulemused võimaldasid meil jälgida fibroosi kineetikat, kasutades tioflaviin T (ThT) testi.Kõigi rekombinantsete spidroiinivalkude puhul suurenes fluorestsentssignaal, kui proove inkubeeriti 37 °C juures (joonis 3f, täiendav joonis 5a).Kooskõlas selle leiuga näitas NT ja His-NT2RepCT mikroskoopiline uurimine geelistumistingimustes ThT fluorestsentsi ühtlast suurenemist ilma ThT-positiivsete agregaatide märgatava lokaalse kuhjumiseta (täiendav joonis 5b, c).ThT-positiivsete fibrillide moodustumisega ei kaasnenud NT ja His-NTCT hägususe suurenemist (täiendav joonis 5d), mis tähendab, et geelis võib tekkida fibrillide võrgustik, ilma et see kahjustaks geeli selgust.Külvamine väikeste koguste eelvormitud fibrillide lisamisega võib märkimisväärselt kiirendada mõnede amüloidide fibrillide moodustumist 42, 43, 44, kuid 5%, 10% või 20% (w/w) NT lisamine NT hüdrokoagulantide lahusele.külviefekt (joonis 3g).Võib-olla on see tingitud sellest, et hüdrogeeli fibrillid on suhteliselt fikseeritud ja neid ei saa seemnetena kasutada.
Rekombinantsete spidroiinivalkude ootamatu käitumine kõrgetel temperatuuridel ajendas täiendavaid tuumamagnetresonantsi (NMR) spektroskoopia uuringuid, et tuvastada geeli moodustumisega seotud konformatsioonilisi muutusi.His-NT2RepCT lahuste NMR-spektrid, mis registreeriti aja jooksul temperatuuril 37 °C, näitasid, et CT oli endiselt osaliselt volditud, samas kui NT ja 2Rep signaalid olid kadunud (joonis 4a), mis viitab sellele, et His-NT ja 2Rep kontrollisid osaliselt His- NT2RepCT hüdrogeel.CT-signaali nõrgenes ka 20% -ni selle algsest intensiivsusest, mis viitab sellele, et CT on samuti enamasti fikseeritud ja integreeritud hüdrogeeli struktuuri.Väiksema osa CT-st, mis on sama liikuv kui eelinkubeeritud proovis ja mida on seega vaadeldud lahuse NMR abil, puuduvad spektrites signaalid esimese 10 struktureeritud jäägi jaoks, mis võib olla tingitud His-NT2Rep kinnitatud osa keerulisest immobiliseerimisest.Hüdrogeelide -NT2RepCT oleku NMR-spektrid näitasid valdavalt α-heeliksite ja β-kihtide olemasolu ning vähemal määral juhuslikku mähise konformatsiooni (joonis 4b).Ainult NT-s esinevate metioniinijääkide keemilise nihke analüüs näitas, et see domeen oli muudetud β-lehe struktuuriks.Lahuses oleva NT ajast sõltuvad spektrid näitasid signaali intensiivsuse ühtlast vähenemist (joonis 4c) ja NT hüdrogeelide tahkis-TMR näitas, et suurem osa NT jääkidest muudeti β-lehtstruktuurideks (joonis 4d).2Rep konformatsiooni ei saanud selle agregeerumise kalduvuse tõttu eraldi määrata.NTCT ja His-NT2RepCT hüdrogeelide tahkis-TMR spektrid nägid aga välja väga sarnased (joonis 4b; täiendav joonis 6b), mis viitab sellele, et 2Rep aitas vähe kaasa His-NT2RepCT hüdrogeeli struktuursele osale.CT-hüdrogeelide puhul leiti, et eksisteerivad α-heeliksid, β-lehed ja juhuslikud spiraalsed sekundaarstruktuurid (täiendav joonis 6d).See viitab sellele, et mõned CT osad jäävad α-heeliteks, samas kui teised muutuvad β-lehtedeks.Seega viitavad NMR-spektroskoopia tulemused sellele, et NT on hüdrogeeli moodustumise jaoks oluline ja muutub 2Rep ja CT-ga liitumisel ka β-lehe konformatsiooniks.Sellega kooskõlas leidsime hiljuti, et amüloidsed ruumilised tõmblukud moodustuvad tõenäoliselt kõigis viies NT-domeeni spiraalis ja Waltzi algoritm ennustas 1. heeliksis amüloidogeenset piirkonda (joonis 4e).
15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT lahuse 2D spektrid enne (sinine) ja 19 tundi pärast inkubeerimist (punane) temperatuuril 37 °C.Üksikud ristpiigid punases spektris ja F24, G136, polüA sinises spektris on tähistatud ühetäheliste aminohapete sümbolite ja jääkide numbritega.Sisetükid näitavad NT, 2Rep ja CT domeenide valitud jääkide signaali intensiivsuse sõltuvust ajast.b His-NT2RepCT hüdrogeelide tahkis-raadiosagedusspektrid (RFDR).RFDR-spektrites täheldatud Cα / Cβ jääkide korrelatsioonid määrati, võrreldes mudelpeptiidide keemiliste nihete ja väärtustega, mis on saadud statistikast82, 83 ja nende sekundaarsetest struktuuridest.SSB – pöörlev külgriba.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT lahuse ühemõõtmelised spektrid inkubeerimise ajal 37 °C juures 36 tundi.Sisend näitab mahulist intensiivsust ajas.d NT hüdrogeelide tahkis-RFDR spektrid.Näidatud on RFDR-spektrites täheldatud Cα/Cβ jääkide ja nende sekundaarstruktuuride korrelatsioonid.e Põhineb Zipperi andmebaasi (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) fibrillatsioonikalduvuse profiilil NT45.79.Heksapeptiidi ruumilise välgu nihke akna Rosetta energia on näidatud kcal / mol.Punased tulbad tähistavad suure fibroosikaldusega heksapeptiide (Rosetta energia alla -23 kcal/mol; punktiirjoone all).Rohelised tulbad näitavad fragmente, mille Rosetta energia on üle läve ja seetõttu on väiksem tõenäosus, et moodustuvad steerilised tõmblukud.Proliini sisaldavad fragmendid jäeti analüüsist välja (ilma veergudeta).Ruudud tähistavad amüloidoosi piirkondi, mida ennustab Waltz algoritm81 (https://waltz.switchlab.org).NT aminohappejääkide järjestus on ülaosas ja β sekundaarstruktuuris leitud jääkide tüübid (määratud tahkis-TMR-spektroskoopia abil) on näidatud punaselt.Viie NT α-heeliksi positsioonid on tähistatud kui (H1-H5)28.
Kui pH on <6,5, HT dimeriseerub, olles vastupidav kuumuse või uurea põhjustatud denaturatsioonile18.Et selgitada, kuidas NT dimerisatsioon ja stabiilsus mõjutavad geelistumist, kontrolliti 100 mg/ml NT-d sisaldavate lahuste pH väärtusi 8, 7 ja 6, kasutades viaali inversiooni testi.pH 8 ja 7 juures inkubeeritud NT proovid geelistusid 30 minuti pärast 37 °C juures, kuid pH 8 geel jäi selgeks, samas kui pH 7 geel näitas nähtavat sadet (joonis 5a).Seevastu HT-d sisaldav lahus pH-ga 6 ei moodustanud geeli ja 20 minuti pärast 37 °C juures võis näha suurt sadet.See viitab sellele, et dimeerid ise ja/või nende suurem stabiilsus võrreldes monomeeridega takistavad geelistumist.NT sademe teket pH 7 ja 6 juures ei olnud oodata, kuna on teatatud, et NT lahustub 200 mg/ml27 juures, voldib pärast kuumdenatureerimist kergesti ümber ja säilitab ka α-heeliksi madalamate väärtuste juures. pH 18. Nende lahknevuste tõenäoline seletus on see, et varem teatatud katsed viidi läbi toatemperatuuril või madalamal või suhteliselt madalatel valgukontsentratsioonidel 16, 18, 19.
NT viaali inversiooni test (100 mg/ml) pH 8, 7, 6 ja 154 mM NaCl (pH 8) juures pärast inkubeerimist 37°C juures.b NT CD spektrid koos ja ilma vastavalt 154 mM NaF ja 154 mM NaCl.Molaarne elliptilisus lainepikkusel 222 nm teisendatakse looduslike voltide osakaaluks.c NT inversiooni test (100 mg/ml) NT* (37 °C ja 60 °C), NTA72R (37 °C) ja His-NT-L6 (37 °C ja 60 °C).d NT mutantide NT*, NTA72R ja His-NT-L6 CD spektrid.Molaarne elliptilisus lainepikkusel 222 nm teisendatakse looduslike voltide osakaaluks.e NTFlSp, NTMiSp ja redutseeritud NTMiSp (100 mg/ml) inversioonitest.Skaala riba 5 mm.f NT, NTFlSp, NTMiSp ja redutseeritud NTMiSp CD spektrid.Molaarne elliptilisus lainepikkusel 222 nm teisendatakse looduslike voltide osakaaluks.Täielikud NT-spektrid temperatuuril 25 ° C ja 95 ° C on näidatud täiendaval joonisel 8.
Füsioloogiline soolakontsentratsioon määrab elektrostaatilise interaktsiooni NT subühikute vahel ja NT ülekande dimeriseerumist madalamale pH-le18.Leidsime, et 154 mM NaCl ja NaF inhibeerisid tõepoolest vastavalt geelistumist (joonis 5a, b; täiendav joonis 2b) ja et need soolad suurendasid NT monomeeride termilist stabiilsust (joonis 5b, täiendav joonis 8). .See viitab ka sellele, et stabiilsuse suurendamine, mitte dimeriseerimine, takistab geeli moodustumist.
Valkude dimerisatsiooni ja stabiilsuse rolli edasiseks uurimiseks geelistamisel kasutasime kahte mutanti, NT * ja NTA72R, mis jäävad ka madala pH 28, 30 juures monomeerseks.NT* on topeltlaengu pöördmutant, milles monomeeri näiv dipolaarne laengujaotus on tasandatud, mis takistab dimeriseerumist ja suurendab drastiliselt monomeeri stabiilsust.NTA72R on laetud dipool, kuid Arg-asendatud Ala asub dimeeri piiril, seega häirivad mutatsioonid dimeriseerumiseks vajalikke subühikute interaktsioone.Inkubeerimisel 37 °C juures ei moodustanud NT* hüdrogeeli, samas kui NTA72R moodustas 15 minuti jooksul läbipaistmatu geeli (joonis 5c).Kuna nii NT* kui ka NTA72R ei saa dimeriseeruda, vaid erinevad monomeeri stabiilsuse poolest (joonis 5d), viitavad need tulemused kindlalt sellele, et kõrge termodünaamiline stabiilsus takistab NT geelistumist.Seda toetab ka tõsiasi, et HT* moodustab geeli, kui see on kõrgel temperatuuril ebastabiilne (8 min pärast 60°C juures; joonis 5c).Varem on näidatud, et NT kõrge metioniini sisaldus vedeldab selle loomulikku voltimist ja kuus Met-Leu asendajat (siin viidatud kui His-NT-L6) stabiliseerivad tugevalt NT46 monomeeri.Lähtudes eeldusest, et NT-geeli moodustumiseks on vajalik struktuurne paindlikkus, leidsime, et His-NT-L6 stabiilne mutant ei geelistunud temperatuuril 37 °C (joonis 5c, d).Kuid His-NT-L6 moodustas ka geeli inkubeerimisel 60 °C juures 60 minutit (joonis 5c).
NT võime muutuda β-lehtstruktuurideks ja moodustada hüdrogeele näib kehtivat mõne, kuid mitte kõigi spidroiini NT domeenide kohta.Erinevatest siiditüüpidest ja ämblikuliikidest pärit NT-d Trichonephila clavipes (NTFlSp) moodustasid geelid vaatamata nende suhteliselt madalale metioniinisisaldusele ja kõrgele termilisele stabiilsusele (joonis 5e, f ja täiendav tabel 2).Seevastu väikese termilise stabiilsuse ja kõrge metioniinisisaldusega Araneus ventricosuse (NTMiSp) väikese ampullaarse valgu spidroiini NT ei moodustanud hüdrogeele (täiendav tabel 2 ja joonis 5e, f).Viimast võib seostada molekulisiseste disulfiidsidemete olemasoluga 29, 47.Järjekindlalt, kui NTMiSp disulfiidsidemeid redutseeriti, moodustas see pärast 10-minutilist inkubeerimist 37 °C juures hüdrogeeli (joonis 5e).Kokkuvõtteks tuleb märkida, et struktuurne paindlikkus on oluline, kuid mitte ainus kriteerium NT-st geeli moodustamisel.Teine tegur, mis võib olla oluline, on kalduvus moodustada amüloidfibrillid ning tõmbluku andmebaasi ja Waltzi algoritmiga tehtud analüüs näitas korrelatsiooni geelide moodustumise võime ja amüloidogeensete piirkondade olemasolu vahel, samuti prognoositud piirkondade ulatuse vahel. steeriliste tõmblukkude moodustamiseks.Ilmnes korrelatsioon (täiendav tabel 2 ja täiendav joonis 9).
NT võime moodustada fibrillid ja moodustada geele soodsates tingimustes pani meid oletama, et NT liitmised teiste valgu fragmentidega võivad siiski moodustada geele, millel on fusioonipartnerite täielik toimimine.Selle testimiseks lisasime NT C-otsa vastavalt rohelise fluorestseeruva valgu (GFP) ja puriinnukleosiidfosforülaasi (PNP).Saadud sulandvalke ekspresseeriti E. coli-s väga kõrge lõppsaagisega (vastavalt 150 mg/l ja 256 mg/l raputuskolvikultuurid His-NT-GFP ja His-NT-PNP jaoks), mis on kooskõlas näidatuga. Muude valkude jaoks, mis on liidetud NT-ga Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/ml) ja His-NT-PNP (100 mg/ml) liitvalgud moodustasid geelid pärast 2 tundi ja 6,5 ​​tundi temperatuuril 37 °C ning mis kõige tähtsam, GFP fraktsioon jäi muutumatuks.täheldati pärast geelistumist, kusjuures >70% esialgsest fluorestsentsi intensiivsusest jäi alles pärast geelistumist (joonis 6a).PNP aktiivsuse mõõtmiseks his-NT-PNP lahustes ja geelides pidime sulandvalku lahjendama NT-ga, kuna puhta preparaadi ensümaatiline aktiivsus jäi geelistuvate kontsentratsioonide korral testi tuvastamisvahemikust välja.0,01 mg/ml His-NT-PNP ja 100 mg/ml NT sisaldava seguga moodustunud geel säilitas 65% eelinkubeeritud proovide esialgsest ensümaatilisest aktiivsusest (joonis 6b).Geel jäi mõõtmise ajal puutumata (täiendav joonis 10).
Suhteline fluorestsentsi intensiivsus enne ja pärast His-NT-GFP (300 mg/ml) ja ümberpööratud viaali, mis sisaldab His-NT-GFP hüdrogeeli (300 mg/ml) geelistamist nähtava ja UV-valguses.Punktid näitavad üksikuid mõõtmisi (n = 3), vearibad näitavad standardhälvet.Keskmine väärtus on näidatud vearibade keskel.b PNP aktiivsus saadi fluoromeetrilise analüüsiga, kasutades lahuseid ja geele, mis koosnesid NT-st (100 mg/ml) ja segust, mis sisaldas 0,01 mg/ml his-NT-PNP ja 100 mg/ml New Taiwani dollareid.Siseküljel on kujutatud ümberpööratud viaal, mis sisaldab His-NT-PNP-d (5 mm skaala riba) sisaldavat hüdrogeeli.
Siin kirjeldame hüdrogeelide moodustumist NT-st ja teistest rekombinantsetest spidroiinivalkudest, inkubeerides valgulahust 37 °C juures (joonis 1).Näitame, et geelistumine on seotud α-heeliksite muutumisega β-kihtideks ja amüloiditaoliste fibrillide moodustumisega (joonised 3 ja 4).See leid on üllatav, kuna NT-d on keerdunud kerakujulised viie heeliksi kimbud, mis on tuntud oma äärmiselt suure lahustuvuse ja kõrge stabiilsuse poolest kontsentratsioonidel >200 mg/ml temperatuuril 4 °C mitu päeva 27.Lisaks volditakse NT-d pärast kuumdenatureerimist hõlpsasti uuesti kokku madala valgukontsentratsiooniga µM.Meie tulemuste kohaselt nõuab fibrillide moodustumine >10 mg/ml valgukontsentratsiooni ja veidi kõrgendatud temperatuuri kombinatsiooni (joonis 1).See on kooskõlas ideega, et amüloidfibrillid võivad moodustuda globulaarselt volditud valkudest, mis on füsioloogilistes tingimustes toimuvate termiliste kõikumiste tõttu osaliselt voldimata olekus 48 .Selle muundamise läbivate valkude näidete hulka kuuluvad insuliin49,50, β2-mikroglobuliin, transtüretiin ja lüsosüüm51,52,53.Kuigi NT on oma olekus α-heeliks, sobib ligikaudu 65% polüpeptiidahelast steerilise tõmbluku moodustumisega (joonis 4e) 45 .Kuna monomeer on dünaamiliselt liikuv46, võib see avaldada need potentsiaalsed amüloidogeensed piirkonnad mõõdukalt kõrgendatud temperatuuridel ja koguvalgu kõrge kontsentratsiooni korral võib see jõuda amüloidfibrillide moodustumise jaoks kriitilise kontsentratsioonini54.Seda arutluskäiku järgides leidsime negatiivse korrelatsiooni spidroiini kontsentratsiooni ja geelistumisaja vahel (joonis 1c) ja kui monomeerse NT konformatsiooni stabiliseeritakse kas mutatsioonide (NT*, His-NT-L6) või soola lisamisega, võib see ära hoida hüdrogeelide moodustumine (joon. 5).
Enamasti kaovad amüloidfibrillid lahusest sadena, kuid teatud tingimustel võivad need moodustada hüdrogeele55,56,57.Hüdrogeeli moodustavatel fibrillidel on tavaliselt kõrge kuvasuhe ja nad moodustavad molekulaarse takerdumise kaudu stabiilseid kolmemõõtmelisi võrke, 55, 58, mis on kooskõlas meie tulemustega.In vitro hüdrogeeli moodustamiseks volditakse valgud sageli täielikult või osaliselt lahti, näiteks kokkupuutel orgaaniliste lahustitega, kõrgel temperatuuril (70–90 °C) ja/või madala pH-ga (1,5–3,0)59, 60, 61, 62.Siin kirjeldatud spidroiini hüdrogeelid ei vaja karmi töötlemist ega hüdrogeelide stabiliseerimiseks ristsiduvaid aineid.
Varem on teatatud, et spidroiini kordused ja QD-d, mis näivad läbivat siidi ketramise ajal β-lehe ümberlülitumist, moodustavad hüdrogeele.Võrreldes meie leidudega olid inkubatsiooniajad ja/või inkubatsioonitemperatuurid vastavalt oluliselt pikemad või kõrgemad ning saadud hüdrogeelid olid sageli läbipaistmatud (joonis 7 ja täiendav tabel 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Lisaks kiirele geelistumisajale ületasid NT hüdrogeelid >300 mg/ml (30%) kõiki teisi kirjeldatud rekombinantseid ämblik-siidivalgu hüdrogeele, aga ka looduslikke hüdrogeele nagu želatiin, alginaat (2%), agar (0,5%) ) ja kollageen.(0,6%) (joonis 7 ja lisatabelid 1 ja 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Selles uuringus võrreldi hüdrogeelide geeliaega ja elastsusmoodulit teiste spidroiinipõhiste hüdrogeelide ja valitud looduslike hüdrogeelidega.Viited on toodud koos geelistumistingimuste kirjeldusega.APS Ammooniumpersulfaat, toatemperatuur.Andmed 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Näib, et ämblikud on välja töötanud viise, kuidas hoida ära spidroiini tarretumist ladustamise ajal.Vaatamata valgu kõrgele kontsentratsioonile siidinäärmes tähendab terminaalse domeeniga seotud suur korduspiirkond, et NT ja CT näiv kontsentratsioon näärmes vastab selle uuringu piiril ligikaudu 10-20 mg/ml.vajalik in vitro täheldatud hüdrogeeli moodustumiseks.Lisaks stabiliseerisid NT sarnased soolade 16 kontsentratsioonid nagu siidinäärmetes (joonis 5b).NT konformatsiooni on uuritud E. coli tsütosoolis ja leitud, et see on tihedamalt volditud kui in vitro uurides, mis näitab veelgi, et sool või muud tegurid takistavad selle agregatsiooni in vivo.Kuid NT-de võime muutuda β-lehe fibrillideks võib olla filamentide moodustamisel oluline ja seda tuleks tulevastes uuringutes uurida.
Lisaks selles uuringus täheldatud NT-amüloiditaolise fibrillide ja hüdrogeeli moodustumise uudsetele aspektidele näitame ka, et sellel nähtusel võivad olla biotehnoloogilised ja biomeditsiinilised rakendused (joonis 8).Kontseptsiooni tõestuseks ühendasime NT GFP või PNP-ga ja näitasime, et sulandvalk moodustab ka hüdrogeele, kui seda inkubeeritakse temperatuuril 37 °C ning et GFP ja PNP fraktsioonid säilitavad suures osas oma aktiivsuse ka pärast geelistamist (joonis 6).Nukleosiidfosforülaasid on nukleosiidianaloogide75 sünteesi olulised katalüsaatorid, mis muudab meie avastuse biofarmatseutilise tööstuse jaoks oluliseks.Soodsates tingimustes läbipaistvaid hüdrogeele moodustavate sulandvalkude ekspresseerimise kontseptsioon võimaldab luua funktsionaliseeritud hüdrogeele, millel on soodsad omadused paljudeks rakendusteks, nagu ensüümide immobiliseerimine, kontrollitud ravimi vabanemine ja koetehnoloogia.Lisaks on NT ja NT* tõhusad ekspressioonimarkerid30, mis tähendab, et NT-d ja selle variante saab kasutada lahustuvate sulandvalkude suure läbilaskevõimega tootmiseks ja järgnevaks immobiliseeritud sihtvalkude loomiseks 3D-hüdrogeelides.
NT on lahustuv, α-spiraalne ja stabiilne madalatel kontsentratsioonidel (µM) ja temperatuuril 37 °C.Samal temperatuuril, kuid kasvavatel kontsentratsioonidel (>10 mg/ml) moodustab NT geelid, mis koosnevad amüloiditaolistest fibrillidest.NT sulandvalgud moodustavad ka fibrillaarseid geele, millel on täielikult funktsionaalsed fusioonfragmendid, võimaldades NT abil 3D-hüdrogeelidesse immobiliseerida erinevaid valke.Alumine: NT (PDB: 4FBS) ja kiudvõrkude ja nendega seotud valgustruktuuride illustratsioonid (eeldatakse ja pole mõõtkavas joonistatud, GFP esialgne eelarveprojekt: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdpdbR).
Konstruktsioonid (vt täielikku loendit, sealhulgas aminohappejärjestusi, vt täiendavat tabelit 4) klooniti plasmiidi pT7 ja transformeeriti E. coli BL21 (DE3).E. coli, mis sisaldas konstrueeritud plasmiide, inokuleeriti Luria puljongis, millele oli lisatud kanamütsiini (70 mg/l), ja kasvatati üleöö temperatuuril 30 °C ja 250 pööret minutis.Seejärel inokuleeriti kultuur 1/100 kanamütsiini sisaldavasse LB söötmesse ja kultiveeriti temperatuuril 30 °C ja 110 pööret minutis, kuni OD600 saavutas 0,8.NMR-uuringute jaoks kasvatati baktereid M9 minimaalses söötmes, mis sisaldas 2 g D-glükoosi 13C (Aldrich) ja 1 g ammooniumkloriidi 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) valgu märgistamiseks isotoopidega.Alandage temperatuur 20 kraadini Celsiuse järgi ja kutsuge esile valgu ekspressioon 0,15 mM isopropüültiogalaktopüranosiidiga (lõppkontsentratsioon).Pärast üleöö valgu ekspressiooni koguti rakud 7278 x g, 4 °C juures 20 minutit.Rakupelletid resuspendeeriti 20 mM Tris-HCl-s, pH 8, ja külmutati kuni edasise kasutamiseni.Sulatatud rakud lüüsiti rakkude lõhkujaga (TS-seeria masinad, Constant Systems Limited, Inglismaa) 30 kPa juures.Seejärel tsentrifuugiti lüsaate 25 000 g juures 30 minutit temperatuuril 4 °C.NTMiSp jaoks resuspendeeriti pellet 2 M uureas, 20 mM Tris-HCl-s, pH 8, ja töödeldi ultraheliga 2 minutit (2 s sisse/välja, 65%), seejärel tsentrifuugiti uuesti 25 000 xg, 4 °C. 30 min.Supernatant kanti Ni-NTA kolonni, pesti 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidasooliga, pH 8, ja lõpuks elueeriti valk 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidasooliga, pH 8. NT2RepCT genereerimiseks ja NTCT, trombiini seedimine tutvustab kohta (ThrCleav) His ja NT vahel.Trombiini lõhustamiskohad on olemas ka His-NT-ThrCleav-2Rep (toodab 2Rep), His-tioredoksiin-ThrCleav-NT (toodab NT), His-tioredoksiin-ThrCleav-CT (toodab CT), His-tioredoksiin-NTThrCleav. .* (toodab NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (toodab NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (toodab NTF1Sp) ja His-Väävel Redoksiin-ThrCleav-NTMiSp (toodab NTMiSp).Konstrukte digereeriti trombiiniga (1:1000) ja dialüüsiti üleöö temperatuuril 4 °C 20 mM Tris-HCl-ga, pH 8, kasutades Spectra/Por dialüüsimembraani molekulmassi läviväärtusega 6-8 kDa.Pärast dialüüsi kantakse lahus Ni-NTA kolonni ja kogutakse huvipakkuvat valku sisaldav heitvesi.Valgu kontsentratsioonid määrati UV-kiirguse neeldumise mõõtmisega 280 nm juures, kasutades iga valgu ekstinktsioonikoefitsienti, välja arvatud NTF1Sp puhul, mis kasutas Bradfordi testi vastavalt tootja protokollile.Puhtus määrati SDS-polüakrüülamiidi (4–20%) geelelektroforeesi ja Coomassie briljantsinise värvimisega.Valgud kontsentreeriti tsentrifuugifiltrite (VivaSpin 20, GE Healthcare) abil kiirusel 4000 xg molekulmassi piirväärtusega 10 kDa 20-minutilise tsükliga.
Sulatage valgulahus ja pipeteerige ettevaatlikult 150 µl 1 ml läbipaistvasse vaheseinaga viaali (8 x 40 mm Thermo Scientific).Torud suleti ja suleti aurustumise vältimiseks parakilega.Proove (n = 3) inkubeeriti 37 °C või 60 °C juures ja geelistumise jälgimiseks pöörati perioodiliselt ümber.Proove, mis ei geelistunud, inkubeeriti vähemalt üks nädal.Vähendage NTMiSp disulfiidsidemeid 10 mM DTT-ga 10 uM valgu kohta.Looduslike ämbliksiidist katete geelistumise analüüsimiseks lõigati rootsi sillaämblik, kaks peamist ampulleeritud nääret asetati 200 μl 20 mM Tris-HCl puhvrisse pH 8 ja lõigati, et kate saaks näärmetest eralduda..Näärmete sisu lahustatakse puhvris, 50 µl kuivmassi määramiseks (avatud viaalide inkubeerimisel temperatuuril 60 °C kuni konstantse massini) ja 150 µl geelistamiseks 37 °C juures.
Mõõtegeomeetria/tööriist on valmistatud roostevabast terasest, kasutades paralleelset plaati, mille ülemine läbimõõt on 20 mm ja vahe 0,5 mm.Kuumutage proov roostevabast terasest põhjaga Peltier plaadi abil temperatuurini 25 °C kuni 45 °C ja tagasi temperatuurini 25 °C kiirusega 1 °C minutis.Vibratsioonimõõtmised viidi läbi sagedusega 0, 1 Hz ja materjali lineaarses viskoelastses piirkonnas pingega 5% ja 0, 5% proovide puhul vastavalt 100 mg / ml ja 300–500 mg / ml.Kasutage aurustumise vältimiseks kohandatud niiskuskambrit.Andmeid analüüsiti Prism 9 abil.
Infrapunaspektrite (IR) kogumiseks toatemperatuuril 800–3900 cm–1.ATR-seadet ja ka spektromeetrit läbivat valgusteed puhastatakse enne katset ja selle ajal kuiva filtreeritud õhuga.Lahused (500 mg/ml, et minimeerida veeabsorptsiooni piike spektrites) pipeteeriti kristallidele ja enne mõõtmist moodustati geelid (500 mg/ml), mis kanti seejärel kristallidesse (n = 3).Salvestati 1000 skaneeringut eraldusvõimega 2 cm-1 ja null töötsükliga 2. Teine tuletis arvutati OPUS-i (Bruker) abil, kasutades üheksapunktilist silumisvahemikku.Spektrid normaliseeriti samale integratsioonipiirkonnale vahemikus 1720–1580 cm-1, kasutades F. Menges'i “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.ATR-IR spektroskoopias sõltub infrapunakiire läbitungimissügavus proovi lainearvust, mille tulemuseks on tugevam neeldumine madalamate lainearvude korral kui suuremate lainearvude korral.Neid efekte ei ole korrigeeritud joonistel fig.3, kuna need on väga väikesed (täiendav joonis 4).Selle näitaja korrigeeritud spektrid arvutati Bruker OPUS tarkvara abil.
Põhimõtteliselt on valgu konformatsioonide põhjalik kvantifitseerimine võimalik pärast komponentide usaldusväärset dekonvolutsiooni amiid I piigis.Praktikas tekivad siiski mõned takistused.Müra spektris võib dekonvolutsiooni ajal ilmneda (vale)piikidena.Lisaks langeb vee paindumisest tulenev piik kokku amiidi I piigi asukohaga ja võib suures koguses vett sisaldavate proovide puhul, nagu siin uuritud vesigeeli puhul, olla sarnase suurusega.Seetõttu ei püüdnud me amiidi I piiki täielikult lagundada ja meie tähelepanekuid tuleks arvesse võtta ainult teiste meetodite, näiteks NMR-spektroskoopia toetuseks.
50 mg/ml NT ja His-NT2RepCT lahused geelistati üle öö temperatuuril 37 °C.Seejärel lahjendati hüdrogeel 20 mM Tris-HCl-ga (pH 8) kontsentratsioonini 12,5 mg/ml, loksutati korralikult ja pipetiti geeli purustamiseks.Järgmisena lahjendati hüdrogeeli 10 korda 20 mM Tris-HCl-ga (pH 8), 5 μl proovi kanti formvariga kaetud vaskvõrele ja liigne proov eemaldati blotpaberiga.Proove pesti kaks korda 5 µl MilliQ veega ja värviti 1% uranüülformiaadiga 5 minutit.Eemaldage liigne plekk imava paberiga, seejärel kuivatage võrk õhu käes.Pildistamine viidi läbi nendel võrkudel, kasutades FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, mis töötas 100 kV juures.Pildid salvestati suurendusega x 26 500 ja x 43 000, kasutades Veleta 2k × 2k CCD-kaamerat (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Saksamaa).Iga proovi jaoks (n = 1) salvestati 10–15 pilti.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) kasutati pildianalüüsiks ja kiudude läbimõõtude mõõtmiseks (n = 100, erinevad kiud).Prismat 9 kasutati paaritute t-testide tegemiseks (kahe sabaga).Keskmised His-NT2RepCT ja NT fibrillid olid vastavalt 11,43 (SD 2,035) ja 7,67 (SD 1,389) nm.Usaldusvahemik (95%) on -4,246 kuni -3,275.vabadusastmed = 198, p < 0,0001.
80 µl vedelaid proove, mis sisaldasid 10 µM tioflaviin T (ThT), mõõdeti kolmes korduses (n = 3) staatilistes tingimustes, kasutades Corningi 96 süvendiga musta põhjaga selgepõhjalisi plaate (Corning Glass 3881, USA).Fluorestsentsi erinevused registreeriti, kasutades 440 nm ergastusfiltrit ja 480 nm emissioonifiltrit (FLUOStar Galaxy firmalt BMG Labtech, Offenburg, Saksamaa).ThT signaal ei olnud küllastunud ega kustutatud, kuna katsed erinevate ThT kontsentratsioonidega viidi läbi ilma signaali intensiivsust muutmata.Uduse mõõtmiseks registreerige neelduvus lainepikkusel 360 nm.Külvamiskatsete jaoks moodustati 100 mg/ml geelid 37 °C juures, resuspendeeriti ja kasutati külvamiseks molaarsuhetes 5%, 10% ja 20%.Andmeid analüüsiti Prism 9 abil.
Sulatage His-NT2RepCT ja NT >100 mg/ml varujäägid jääl ja filtreerige läbi 0,22 µm filtri.Kontsentratsioonid arvutati neeldumise mõõtmisega 280 nm juures, kasutades Nanodropi.Läbipaistva põhjaga 96-süvendilise musta mittesiduva plaadi (Corning) süvendites lahjendati proovid kontsentratsioonini 20 mg/ml 20 mM Tris-HCl-s pH 8 ja segati 5 µM ThT-ga (lõppkontsentratsioon), proovi kogukontsentratsioon. 50 μl maht.Proove pildistati iga 10 minuti järel temperatuuril 37 °C CellObserveri (Zeiss) mikroskoobiga, millel oli läbiva valguse kanal ning FITC ergastus- ja emissioonifiltri komplektid ThT-pildistamiseks.Pildistamiseks kasutatakse 20x/0,4 objektiivi.Pildianalüüsiks kasutati Zen Blue (Zeiss) ja ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Geeleid valmistati ka NT ja His-NT2RepCT lahustest kontsentratsiooniga 50 mg/ml, mis sisaldasid 20 mM Tris pH 8 ja 5 uM ThT ning inkubeeriti 37 °C juures 90 minutit.Geelitükid kanti uude süvendisse, mis sisaldas 20 mM Tris, pH 8 ja 5 µM ThT, mittesiduvale mustale 96 süvendiga läbipaistvale põhjaplaadile.Saate hankida rohelist fluorestsentsi ja eredaid pilte suurendusega 20x/0,4.Pildianalüüsiks kasutati ImageJ-d.
Lahuse NMR spektrid saadi 310 K juures 600 MHz Bruker Avance Neo spektromeetriga, mis oli varustatud QCI Quadrupole Resonance Impulss Gradient Field Cryoprobe'iga (HFCN).NMR proovid, mis sisaldavad 10 mg/ml homogeenset valku, mis on märgistatud 13C, 15N, lahustatuna 20 mM Tris-HCl-s (pH 8), 0,02% (mass/maht) NaN3, 5% DO (maht/maht), (n = 1) .Piigi 23 määramiseks 15N-HSQC 2D spektris kasutati NT2RepCT keemilisi nihkeid pH 6,7 juures.
13C, 15N-märgistatud hüdrogeelide maagilise nurgaga pöörleva tahke NMR (MAS) spektrid registreeriti Bruker Avance III HD spektromeetriga 800 MHz juures, mis oli varustatud 3,2 mm 13C/15N{1H} elektronideta sondiga.Proovi temperatuuri kontrolliti muutuva temperatuuriga gaasivooga 277 K juures. Kahemõõtmelise dipooli pöörlemisresonantsi (DARR)76 ja raadiosagedusliku taasühendamise (RFDR)77 spektrid saadi vastavalt MAS sagedustel 12,5 kHz ja 20 kHz.Ristpolarisatsioon (CP) vahemikus 1H kuni 13C viidi läbi lineaarse rambi abil 60,0 kuni 48,0 kHz 1H juures, 61,3/71,6 kHz 13 °C juures (12,5/20 kHz MAS) ja kontaktaega 0,5–1 ms.Andmete kogumisel kasutati Spinal6478 lahtisidumist sagedusel 73, 5 kHz.Omandamisaeg oli 10 millisekundit ja tsükli viivitus oli 2,5 sekundit.RFDR-spektrites täheldatud üksikult seotud Cα / Cβ korrelatsioonid määrati DARR-spektrite iseloomulike jäägi tüüpi keemiliste nihete ja mitmekordselt seotud korrelatsioonide põhjal.
Zipper79 andmebaasi (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) kasutati NT, NTFlSp ja NTMiSp laperdamissuundumuste ja Rosetta energia hindamiseks.Zipperi andmebaas arvutab välja Rosetta Energy80, mis ühendab mitu vaba energia funktsiooni, et modelleerida ja analüüsida valgu struktuuri.Energiatase -23 kcal/mol või madalam viitab suurele kalduvusele fibrilleerumisele.Madalam energia tähendab kahe β-ahela suuremat stabiilsust tõmbluku konformatsioonis.Lisaks kasutati Waltzi algoritmi amüloidogeensete piirkondade ennustamiseks NT, NTFlSp ja NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT-valgu lahus segati 2-(N-morfolino)etaansulfoonhappe (MES) puhvriga pH 5,5 ja 6,0 juures, et alandada pH vastavalt 6 ja 7-ni.Valgu lõplik kontsentratsioon oli 100 mg/ml.
Mõõtmised viidi läbi J-1500 CD spektromeetril (JASCO, USA), kasutades 300 µl küvetti, mille optiline tee oli 0,1 cm.Valgud lahjendati 20 mM fosfaatpuhvris (pH 8) kuni 10 μM (n = 1).Valkude stabiilsuse analüüsimiseks soola juuresolekul analüüsiti valke samal kontsentratsioonil (n = 1) 20 mM fosfaatpuhvris (pH 8), mis sisaldas vastavalt 154 mM NaF või NaCl.Temperatuuri skaneeringud registreeriti 222 nm juures 25 °C kuni 95 °C kuumutamiskiirusega 1 °C/min.Natiivselt volditud valkude osakaal arvutati valemiga (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Lisaks registreeriti iga proovi jaoks viis spektrit vahemikus 260 nm kuni 190 nm temperatuuril 25 °C ja pärast kuumutamist temperatuurini 95 °C.Viis spektrit keskmistati, siluti ja teisendati molaarseks elliptilisuseks.Andmeid analüüsiti Prism 9 abil.
His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µL) fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti kolmes korduses (n = 3) 96-süvendilistel musta läbipaistva põhjaga Corningi plaatidel (Corning Glass 3881, USA) staatilistes tingimustes.Mõõtke proove fluorestsentsil põhineva plaadilugejaga, mille ergastuslainepikkus on 395 nm, ja registreerige emissioon 509 nm juures enne geelistumist ja 2 tundi hiljem temperatuuril 37 °C.Andmeid analüüsiti Prism 9-ga.
Puriinnukleosiidi fosforülaasi aktiivsuse analüüsi komplekti (fluoromeetriline meetod, Sigma Aldrich) kasutati vastavalt tootja juhistele.His-NT-PNP-d sisaldavate geelide ja lahuste aktiivsuse mõõtmiseks segage 10 ng His-NT-PNP-d 100 mg/ml NT-ga kogumahuni 2 µL, kuna geel andis signaali, mis ületab komplekti tuvastamise intervalli.Kaasati kontrollid geelide ja lahuste jaoks ilma His-NT-PNP-ta.Mõõtmised viidi läbi kaks korda (n = 2).Pärast aktiivsuse mõõtmist reaktsioonisegu eemaldati ja geel pildistati, et tagada geeli säilimine mõõtmise ajal.Andmeid analüüsiti Prism 9 abil.
Lisateavet uuringu kavandamise kohta leiate selle artikliga lingitud loodusõppe kokkuvõttest.
Joonistel 1 ja 2 on toodud lähteandmed.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f ja 6, täiendavad joonised.3, täiendav joonis fig.5a, d, täiendav joonis fig.6 ja täiendav joonis fig.8. Andmed Selle uuringu andmeid majutatakse Zenodo andmebaasis https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Selles uuringus saadud NMR-andmed postitati BMRBigi hoidlasse kirje ID bmrbig36 all.GFP ja PNP struktuurid võeti esialgsest eelarveprojektist (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. ja Johansson, J. Kunstämbliku siidi ketramine.Rahvuslik keemia.bioloogia.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes genoom tõstab esile ämbliku siidi geenide mitmekesisust ja nende keerulist ekspressiooni.National Genette.49, 895–903 (2017).