347 12,7 * 1,24 mm roostevabast terasest spiraaltorud, α-sünukleiini ja tau sünkroonse elektrostaatilise kondensatsiooni ja koagulatsiooni molekulaarne mehhanism

Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Kasutate piiratud CSS-i toega brauseri versiooni.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Lisaks näitame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiilide ja JavaScriptita.
Liugurid, mis näitavad kolme artiklit slaidi kohta.Kasutage slaidide vahel liikumiseks nuppu Tagasi ja Järgmine või igal slaidil liikumiseks lõpus olevaid slaidijuhtnuppe.

347 roostevabast terasest toru spetsifikatsioon

347 12,7*1,24mm Roostevabast terasest spiraaltoru

Välisläbimõõt: 6,00 mm OD kuni 914,4 mm OD, suurused kuni 24” NB saadaval Laost, OD suurus Terastorud saadaval Laost

SS 347 torude paksuse vahemik: 0,3–50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S jne (0,5–12 mm) või ebatavaline suurus, mida saab vastavalt vajadusele kohandada

Tüüp: SS 347 õmblusteta torud |SS 347 ERW torud |SS 347 keevitatud torud |SS 347 valmistatud torud |SS 347 CDW torud, LSAW torud / õmblusega keevitatud / uuesti tõmmatud

Vorm: SS 347 ümmargused torud/torud, SS 347 kandilised torud/ torud, SS 347 ristkülikukujulised torud, SS 347 spiraaltorud, SS 347 "U" kuju, SS 347 pannkoogirullid, SS 347 hüdraulikatorud

Pikkus: üksikjuhuslik, topeltjuhuslik ja nõutav pikkuse ots: tasane ots, kaldus ots, tallatud

Otsakaitse: plastkorgid |Välisviimistlus: 2B, nr 4, nr 1, nr 8 peegelviimistlus roostevabast terasest torudele, viimistlus vastavalt kliendi nõuetele

Tarneseisund: lõõmutatud ja marineeritud, poleeritud, heledaks lõõmutatud, külmtõmmatud

Ülevaatus, katsearuanded: veski testimise sertifikaadid, EN 10204 3.1, keemiaaruanded, mehaanilised aruanded, PMI testimise aruanded, visuaalse kontrolli aruanded, kolmanda osapoole kontrolliaruanded, NABL-i heakskiidetud laboriaruanded, destruktiivsete katsete aruanded, mittepurustavate katsete aruanded

Pakkimine: pakitud puitkarpidesse, kilekottidesse, komplektis terasribadesse või vastavalt kliendi soovile

Eripakkumised: nõudmisel saab valmistada ka muid suurusi ja spetsifikatsioone

SS 347 toru suuruse vahemik: 1/2 tolli NB, OD kuni 24 tolli

ASTM A312 347: Õmblusteta ja sirge õmblusega keevitatud austeniittoru, mis on ette nähtud kõrgel temperatuuril ja üldiseks söövitavaks kasutamiseks.Täitemetall ei ole keevitamise ajal lubatud.

ASTM A358 347: elektriline sulakeevitatud austeniittoru söövitava ja/või kõrge temperatuuriga tööks.Tavaliselt toodetakse selle spetsifikatsiooni kohaselt ainult kuni 8-tollist toru.Keevitamise ajal on lubatud täitematerjali lisamine.

ASTM A790 347: Õmblusteta ja sirge õmblusega keevitatud ferriit/austeniit (dupleks) toru, mis on ette nähtud üldiseks söövitamiseks, pöörates erilist tähelepanu vastupidavusele pingekorrosioonipragudele.

ASTM A409 347: Sirge- või spiraalõmblusega elektriliselt keevitatud suure läbimõõduga austeniitsest kergseintoru suurustega 14” kuni 30” seintega Sch5S ja Sch 10S söövitavate ja/või kõrgete materjalide jaoks

ASTM A376 347: õmblusteta austeniittoru kõrge temperatuuriga rakendusteks.

ASTM A813 347: ühe õmblusega, ühe- või topeltkeevitatud austeniittoru kõrge temperatuuriga ja üldiste söövitavate rakenduste jaoks.

ASTM A814 347: külmtöödeldud keevitatud austeniittoru kõrgel temperatuuril ja üldiseks söövitavaks kasutamiseks.

347H roostevabast terasest torude keemiline koostis

Roostevabast terasest 347H torude mehaanilised omadused

Roostevabast terasest 347H torude füüsikalised omadused

Samaväärsed klassid 347H roostevabast terasest torule

Amüloid-alfa-sünukleiini (αS) agregatsioon on Parkinsoni tõve ja teiste sünukleinopaatiate tunnus.Hiljuti on Alzheimeri tõvega tavaliselt seostatud tau-valku seostatud αS-patoloogiaga ja leitud, et see paikneb koos αS-rikastes inklusioonides, kuigi kahe valgu koagulatsiooni molekulaarne mehhanism jääb ebaselgeks.Siin teatame, et αS faas eraldub vedelateks kondensaatideks elektrostaatilise kompleksse kondensatsiooni teel positiivselt laetud polüpeptiididega, nagu tau.Sõltuvalt αS afiinsusest polükatioonide suhtes ja hüübimisvõrgu valentsi kadumise kiirusest läbivad trombid kiire geelistumise või ühinemise, millele järgneb aeglane amüloidi agregatsioon.Kombineerides täiustatud biofüüsikaliste tehnikate komplekti, suutsime iseloomustada vedelik-vedelik αS / Tau faasi eraldamist ja tuvastada peamised tegurid, mis viivad mõlemat valku sisaldavate heterogeensete agregaatide moodustumiseni vedelas valgukondensaadis.
Lisaks membraaniosadele saab rakkude ruumilist eraldamist saavutada ka valgurikaste, vedelikutaoliste tihedate kehade, mida nimetatakse biomolekulaarseteks kondensaatideks või tilkadeks, moodustamisega protsessi kaudu, mida nimetatakse vedel-vedelik faasieraldus (LLPS).Need tilgad moodustuvad mitmevalentsete ajaliste interaktsioonide kaudu, tavaliselt valkude või valkude ja RNA vahel, ning täidavad mitmesuguseid funktsioone peaaegu kõigis elussüsteemides.Paljudel LLP-võimelistel valkudel on madala keerukusega järjestused, mis on oma olemuselt ja biomolekulaarsete kondensaatide moodustumisel väga korrapäratud 3, 4, 5.Arvukad eksperimentaalsed uuringud on paljastanud nende vedelikutaoliste kondensaatide moodustavate valkude paindliku, sageli korrastamata ja mitmevalentse olemuse, kuigi vähe on teada spetsiifilistest molekulaarsetest determinantidest, mis kontrollivad nende kondensaatide kasvu ja küpsemist tahkemaks sarnaseks. olek..
Uued andmed toetavad hüpoteesi, et ebanormaalne valgupõhine LLPS ja tilkade muundumine tahketeks struktuurideks võivad olla olulised rakulised rajad, mis põhjustavad lahustumatute toksiliste agregaatide moodustumist, mis on sageli degeneratiivsete haiguste tunnused.Paljud LLPS-iga seotud sisemiselt korrastamata valgud (IDP-d), sageli kõrgelt laetud ja paindlikud, on amüloidi agregatsiooni protsessi kaudu pikka aega seotud neurodegeneratsiooniga.Eelkõige on näidatud, et biomolekulaarsed IDP-kondensaadid, nagu FUS7 või TDP-438, või suurte madala keerukusega domeenidega valgud, nagu hnRNPA19, vananevad geelitaoliseks või isegi tahkeks vormiks keevkihistamise protsessi kaudu.ühend.tahke faasi üleminekule (LSPT) aja funktsioonina või vastusena teatud translatsioonijärgsetele modifikatsioonidele või patoloogiliselt olulistele mutatsioonidele1,7.
Teine LLPS-iga in vivo seotud IDP on Tau, mikrotuubulitega seotud korrastamata valk, mille amüloidi agregatsioon on seotud Alzheimeri tõvega10, kuid on hiljuti seotud ka Parkinsoni tõvega (PD) ja teiste sünaptiliste tuumaproteinopaatiate 11, 12, 13 on sellega seotud.On näidatud, et Tau eraldub spontaanselt lahusest/tsütoplasmast soodsate elektrostaatiliste interaktsioonide tõttu14, mille tulemuseks on tau-rikastatud tilkade moodustumine, mida tuntakse elektrostaatiliste koatservaatidena.Samuti on täheldatud, et seda tüüpi mittespetsiifiline interaktsioon on paljude looduses esinevate biomolekulaarsete kondensaatide liikumapanev jõud15.Tau valgu puhul saab elektrostaatilise agregatsiooni moodustada lihtsa agregatsiooni teel, mille käigus valgu vastaslaenguga piirkonnad vallandavad lõhustamisprotsessi, või kompleksse agregatsiooniga interaktsiooni kaudu negatiivselt laetud polümeeridega nagu RNA.
Hiljuti on raku- ja loommudelites demonstreeritud α-sünukleiini (αS), amüloidset IDP-d, mis on seotud PD ja teiste neurodegeneratiivsete haigustega, mida ühiselt tuntakse sünukleinopaatiana 17, 18, ja mis on kontsentreeritud vedelikutaolise käitumisega valgukondensaatidesse.In vitro uuringud on näidanud, et αS läbib LLPS-i lihtsa agregatsiooni teel valdavalt hüdrofoobsete interaktsioonide kaudu, kuigi see protsess nõuab erakordselt kõrgeid valgukontsentratsioone ja ebatüüpiliselt pikki inkubatsiooniaegu 19, 21.See, kas in vivo täheldatud αS-d sisaldavad kondensaadid moodustuvad selle või mõne muu LLPS-i protsessiga, jääb oluliseks lahendamata probleemiks.Sarnaselt, kuigi αS amüloidi agregatsiooni on täheldatud neuronites PD ja teiste sünukleinopaatiate korral, jääb täpne mehhanism, mille abil αS rakusisese amüloidi agregatsiooni läbib, ebaselge, kuna selle valgu üleekspressioon ei paista seda protsessi iseenesest käivitavat.Sageli on vaja täiendavat rakukahjustust, mis viitab sellele, et rakusiseste αS amüloidisõlmede taastuumamiseks on vaja teatud raku asukohti või mikrokeskkondi.Üks rakukeskkond, mis on eriti vastuvõtlik agregatsioonile, võib olla valgukondensaatide sisemus 23 .
Huvitaval kombel on leitud, et αS ja tau paiknevad Parkinsoni tõve ja teiste sünukleinopaatiat põdevatel inimestel iseloomulikes haigussulgudes 24, 25 ja katsed on teatanud sünergilisest patoloogilisest seosest kahe valgu vahel 26, 27, mis viitab potentsiaalsele seosele αS ja agregatsiooni agregatsiooni vahel. tau neurodegeneratiivsete haiguste korral.haigus.On leitud, et αS ja tau interakteeruvad ja soodustavad üksteise agregatsiooni in vitro ja in vivo 28, 29 ning nendest kahest valgust koosnevaid heterogeenseid agregaate on täheldatud sünukleinopaatiaga patsientide ajus 30 .Siiski on vähe teada αS ja tau vahelise interaktsiooni molekulaarsest alusest ja selle koosagregatsiooni mehhanismist.On teatatud, et αS interakteerub tau-ga elektrostaatilise külgetõmbe kaudu αS tugevalt negatiivselt laetud C-terminaalse piirkonna ja tau keskse proliinirikka piirkonna vahel, mis on samuti rikastatud positiivselt laetud jääkidega.
Selles uuringus näitame, et αS võib tõepoolest dissotsieeruda tilkadeks elektrostaatilise kompleksse kondensatsiooni kaudu tau valgu juuresolekul, erinevalt selle interaktsioonist teiste positiivselt laetud polüpeptiididega, nagu polü-L-lüsiin (pLK), ja selles protsessis .αS toimib tilkade võrgu karkassimolekulina.Oleme tuvastanud märgatavad erinevused elektrostaatiliste αS koatservaatide küpsemise protsessis, mis on seotud koatservaadi võrgus osalevate valkude interaktsiooni valentsi ja tugevuse erinevustega.Huvitaval kombel täheldasime αS ja tau amüloidvalkude koosagregatsiooni pikaealistes vedelates koatservaatides ja tuvastasime mõned võtmetegurid, mis viivad nende kahe valgu koosagregeerumiseni sellistes koatservaatides.Siin kirjeldame üksikasjalikult seda protsessi, mis on võimalik molekulaarne mehhanism, mis on kahe valgu kolokaliseerimise aluseks haigusspetsiifilistes kandetes.
αS-l on neutraalse pH juures väga anioonne C-terminaalne saba (joonis 1a) ja me oletasime, et see võib läbida LLPS-i elektrostaatiliste komplekside kondenseerumisel polükatioonsete korrastamata polüpeptiidimolekulidega.Kasutasime 100-jäägilist polü-L-lüsiini (pLK) lähtemudelmolekulina selle positiivselt laetud ja korrastamata polümeerse olemuse tõttu neutraalse pH 32 juures. Esiteks kinnitasime, et pLK interakteerub αS Ct domeeniga lahuse NMR spektroskoopia abil. (Joonis 1b), kasutades 13C/15N-märgistatud αS suureneva αS:pLK molaarsuhte juuresolekul.PLK interaktsioon αS Ct-domeeniga väljendub keemilise nihke häiretes ja piigi intensiivsuse vähenemises selles valgu piirkonnas.Huvitav on see, et kui me segasime αS pLK-ga αS kontsentratsioonil umbes.5–25 µM polüetüleenglükooli (5–15% PEG-8) juuresolekul (tüüpiline LLPS puhver: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) läbisime kohe laia valgu moodustumise välja .tilka jälgiti fluorestsents- (WF) ja heleda välja (BF) mikroskoopia abil (joonis 1c).1–5 µm tilgad, mis sisaldavad kontsentreeritud αS (lisatud 1 µM AlexaFluor488-ga märgistatud αS, AF488-αS), nende elektrostaatilisi omadusi saab tuletada nende vastupidavusest 10% 1,6-heksaandioolile (1,6-HD) ja selle tundlikkusest NaCl kontsentratsiooni tõus (joonis 1c).αS/pLK elektrostaatilise kompleksi koatservaatide vedelikutaolist olemust näitab nende võime sulanduda millisekundite jooksul (joonis 1d).Turbidimeetria abil kvantifitseerisime nendes tingimustes tilkade moodustumist, kinnitasime selle stabiilsusega seotud peamise interaktsiooni elektrostaatilist olemust (joonis 1e) ja hindasime erinevate polümeeride suhete mõju LLPS-protsessile (joonis 1f).Kuigi tilkade moodustumist täheldatakse paljudes polümeeride suhetes, on protsess väga soodne, kui pLK on üle αS.LLP-sid on täheldatud ka keemiliselt erineva tõrjuva aine dekstraan-70 (70 kDa) kasutamisel või mitmesuguste proovivormingute, sealhulgas klaasklaasi tilkade, mitmesuguste materjalide mikroplaadi süvendite, Eppendorfi või kvartskapillaaride kasutamisel.
selles uuringus kasutatud WT-αS ja ΔCt-αS variantide erinevate valgupiirkondade skemaatiline esitus.Amfipaatiline N-terminaalne domeen, hüdrofoobne amüloidi moodustav (NAC) piirkond ja negatiivselt laetud C-terminaalne domeen on näidatud vastavalt sinise, oranži ja punase värviga.Kuvatakse WT-αS netotasu jääkmaksumuse (NCPR) kaart.b αS/pLK interaktsiooni TMR analüüs makromolekulaarsete tükkide puudumisel.Kui pLK kontsentratsioon suureneb (αS:pLK molaarsuhted 1:0,5, 1:1,5 ja 1:10 on näidatud vastavalt helerohelise, rohelise ja tumerohelise värviga).c Koacerveerida αS/pLK (molaarsuhe 1:10) 25 µM juures (1 µM AF488-ga märgistatud αS või Atto647N-märgistatud pLK WF-i pildistamiseks) LLPS puhvris (ülemine) või täiendatud 500 mM NaCl-ga (all vasakul) või pärast % 1,6-heksaandiool (1,6-HD; all paremal).Skaalariba = 20 µm.d Tüüpilised mikroskoopilised kujutised αS/pLK (molaarsuhe 1:10) BF tilkade liitmisest kontsentratsioonil 25 μM;nooled näitavad üksikute tilkade (punased ja kollased nooled) ühendamist uueks tilgaks (oranž nool) 200 ms jooksul) .Skaalariba = 20 µm.e Valguse hajumine (350 nm juures) αS/pLK agregatsioon LLPS puhvris enne ja pärast 500 mM NaCl või 10% 1,6-HD lisamist 25 µM αS juures (N = 3 proovi kordust, näidatud ka keskmine ja standardhälve).f BF-kujutis (ülemine) ja valguse hajumise analüüs (350 nm juures, alumine) αS/pLK agregatsiooni 25 μM αS juures αS:pLK molaarsuhte suurenemisega (N = 3 proovi kordust, näidatud ka keskmine ja standardhälve).Skaalariba = 10 µm.Ühe pildi mastaabiriba näitab kõigi ühel paneelil olevate piltide skaalat.Toorandmed esitatakse töötlemata andmefailide kujul.
Tuginedes meie tähelepanekutele αS / pLK elektrostaatilise kompleksi kondenseerumise kohta ja varasematele tähelepanekutele αS kui tau / RNA kondensaadi klientmolekuli kohta otsese interaktsiooni kaudu tau31-ga, oletasime, et αS ja tau võivad RNA puudumisel lahustiga koos segregeeruda. kondensatsioon.elektrostaatiliste komplekside kaudu ja αS on karkassi valk αS / Tau koatservaatides (vt tau laengu jaotust joonisel 2e).Täheldasime, et kui LLPS puhvris segati kokku 10 μM αS ja 10 μM Tau441 (sisaldab vastavalt 1 μM AF488-αS ja 1 μM Atto647N-Tau), moodustasid need kergesti mõlemat valku sisaldavad valguagregaadid, nagu on näha WF mikroskoopia abil.(joonis 2a).Kahe valgu kolokaliseerumist tilkades kinnitati konfokaalse (CF) mikroskoopia abil (täiendav joonis 1a).Sarnast käitumist täheldati ka siis, kui dekstraan-70 kasutati agregatsiooniagensina (täiendav joonis 1c).Kasutades kas FITC-märgistatud PEG-i või dekstraani, leidsime, et mõlemad väljatõrjuvad ained olid proovide vahel ühtlaselt jaotunud, ei näidanud segregatsiooni ega seost (täiendav joonis 1d).Pigem viitab see sellele, et selles süsteemis soodustavad nad faaside eraldamist makromolekulaarsete väljatõrjumise efektide kaudu, kuna PEG on eelistatavalt stabiilne väljatõrjumisagens, nagu on näha teistes LLP-süsteemides 33, 34.Need valgurikkad tilgad olid tundlikud NaCl (1 M), kuid mitte 1,6-HD (10% maht/maht) suhtes, kinnitades nende elektrostaatilisi omadusi (täiendav joonis 2a, b).Nende vedeliku käitumist kinnitas BF-mikroskoopia abil millisekundiliste tilkade liitumise jälgimine (joonis 2b).
αS/Tau441 koatservaatide konfokaalsed (CF) mikroskoopiakujutised LLPS puhvris (10 μM igast valku, 0,5 μM AF488-ga märgistatud αS ja Atto647N-ga märgistatud Tau441).b αS/Tau441 tilkade liitmise sündmuste tüüpilised diferentsiaalinterferentsi kontrasti (DIC) kujutised (10 μM iga valgu kohta).c Faasidiagramm, mis põhineb Tau441 LLPS (0–15 µM) valguse hajumisel (350 nm juures) 50 µM αS puudumisel (vasakul) või juuresolekul (paremal).Soojemad värvid näitavad suuremat hajumist.d αS/Tau441 LLPS proovide valguse hajumine suureneva αS kontsentratsiooniga (Tau441 5 µM juures, N = 2–3 proovikordust, nagu näidatud).e Skemaatiline esitus selles uuringus kasutatud tau valgu variantidest ja valgu erinevatest piirkondadest: negatiivselt laetud N-terminaalne domeen (punane), proliinirikas piirkond (sinine), mikrotuubuleid siduv domeen (MTBD, esile tõstetud oranžiga) ja amüloidi moodustav paarispiraal.filamentpiirkonnad (PHF), mis asuvad MTBD-s (hall).Kuvatakse Tau441 netotasu jäägi kohta (NCPR) kaart.f Kasutades 1 µM AF488-märgistatud αS-i ja Atto647N-märgistatud ΔNt-, kasutades 1 µM AF488-märgistatud αS-i või ΔCt-αS-i ΔNt-Tau juuresolekul (ülemine, 10 µM valgu kohta, K15 µM (valgu kohta) kohta) ) ) ) LLPS- või K18-puhvris kondenseeritud WF-i mikropildid.Ühe pildi mastaabiribad tähistavad kõigi ühel paneelil olevate piltide skaalat (20 µm paneelide a, b ja f puhul).Paneelide c ja d toorandmed esitatakse töötlemata andmefailidena.
Et testida αS rolli selles LLPS protsessis, uurisime esmalt αS mõju tilkade stabiilsusele nefelomeetria abil, kasutades NaCl kasvavaid kontsentratsioone (joonis 2c).Mida kõrgem on soola kontsentratsioon αS-i sisaldavates proovides, seda kõrgemad on valguse hajumise väärtused (350 nm juures), mis näitab αS-i stabiliseerivat rolli selles LLPS-süsteemis.Sarnast efekti võib täheldada, suurendades αS kontsentratsiooni (ja seega ka αS:Tau441 suhet) ligikaudu.10-kordne tõus tau kontsentratsiooni suhtes (5 uM) (joonis 2d).Näitamaks, et αS on koatservaatides karkassvalk, otsustasime uurida LLPS-ga häiritud Tau mutandi käitumist, millel puudub negatiivselt laetud N-terminaalne piirkond (jäägid 1–150, vt joonis 2e), mida nimetatakse ΔNt-Tau-ks.WF-mikroskoopia ja nefelomeetria kinnitasid, et ΔNt-Tau ise ei läbinud LLPS-i (joonis 2f ja täiendav joonis 2d), nagu varem teatatud 14. Kui aga selle kärbitud Tau variandi dispersioonilahustele lisati αS, oli LLPS-protsess täielikult läbi. taastati tilkade tihedusega, mis on sarnane Tau ja αS täissuuruses lahuste tilkade tihedusele sarnastes tingimustes ja valgukontsentratsioonides.Seda protsessi saab jälgida ka madala makromolekulaarse väljatõrjumise tingimustes (täiendav joonis 2c).C-otsa αS piirkonna, kuid mitte kogu pikkuse, rolli LLPS protsessis demonstreeris tilkade moodustumise pärssimine, kasutades C-otsa kärbitud αS varianti, millel puuduvad (ΔCt-) jäägid 104–140 (joonis 1a). αS) valku (joonis 2f ja täiendav joonis 2d).αS ja ΔNt-Tau kolokaliseerimine kinnitati konfokaalse fluorestsentsmikroskoopia abil (täiendav joonis 1b).
Tau441 ja αS vahelise LLPS-i mehhanismi edasiseks testimiseks kasutati täiendavat Tau varianti, nimelt paaritud spiraalse filamendi südamiku (PHF) fragmenti mikrotuubulit siduvas domeenis (MTBD), mis sisaldab nelja iseloomulikku kordusdomeeni, mida tavaliselt tuntakse. nagu K18 fragment (vt joonis 2e).Hiljuti teatati, et αS seondub eelistatult tau-valguga, mis asub proliinirikkas domeenis järjestuses, mis eelneb mikrotuubulit siduvale domeenile.Kuid PHF-i piirkond on rikas ka positiivselt laetud jääkide poolest (vt joonis 2e), eriti lüsiini (15% jääke), mis ajendas meid testima, kas see piirkond aitab kaasa ka αS / Tau kompleksi kondenseerumisele.Me täheldasime, et K18 üksi ei suutnud testitud tingimustes (LLPS-i puhver 15% PEG-i või 20% dekstraaniga) kontsentratsioonidel kuni 100 μM käivitada (joonis 2f).Kui aga lisasime 50 µM αS 50 µM K18-le, täheldati nefelomeetria (täiendav joonis 2d) ja WF mikroskoopia (joonis 2f) abil K18 ja αS sisaldavate valgutilkade kiiret moodustumist.Nagu oodatud, ei suutnud ΔCt-αS taastada K18 LLPS-i käitumist (joonis 2f).Märgime, et αS / K18 agregatsioon nõuab LLPS-i esilekutsumiseks veidi kõrgemaid valgukontsentratsioone võrreldes αS / ΔNt-Tau või αS / Tau441-ga, kui muud asjad on võrdsed.See on kooskõlas αS C-terminaalse piirkonna tugevama interaktsiooniga proliinirikka Tau domeeniga võrreldes mikrotuubuleid siduva domeeniga, nagu eelnevalt kirjeldatud 31 .
Arvestades, et ΔNt-Tau ei saa αS puudumisel LLPS-i teostada, valisime selle Tau variandi mudeliks αS / Tau LLPS-i iseloomustamiseks, arvestades selle lihtsust täispika Tau-ga LLPS-süsteemides (isotüüp, Tau441 / Tau441).komplekssete (heterotüüpsete, αS/Tau441) agregatsiooniprotsessidega.Võrdlesime αS agregatsiooni astet (kondenseeritud faasivalgu fαS,c osana) αS/Tau ja αS/ΔNt-Tau süsteemides tsentrifuugimise ja dispergeeritud faasi SDS-PAGE analüüsi abil (vt 2e), leidsime väga sarnased väärtused. kõigi valkude jaoks samas kontsentratsioonis.Täpsemalt, me saime fαS,c 84 ± 2% ja 79 ± 7% vastavalt αS / Tau ja αS / ΔNt-Tau jaoks, mis viitab sellele, et αS ja tau vaheline heterotüüpne interaktsioon on parem kui tau molekulide vaheline interaktsioon.vahel.
Koostoimet erinevate polükatioonidega ja kondensatsiooniprotsessi mõju αS kineetikale uuriti esmalt fluorestsentsi taastumise pärast fotovalgenduse (FRAP) meetodil.Testisime αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ja αS/pLK koatservaate (100 μM αS, millele oli lisatud 2 μM αS AF488-αS ja 100 μM Tau441 või ΔNt-MLK p või).Andmed saadi esimese 30 minuti jooksul pärast proovi komponentide segamist.Tüüpilistest FRAP-piltidest (joonis 3a, αS/Tau441 kondensatsioon) ja nende vastavatest ajakõveratest (joonis 3b, täiendav joonis 3) on näha, et αS kineetika on väga sarnane Tau441 koatservaatide omaga.ja ΔNt-Tau, mis on pLK-ga palju kiirem.Arvutatud difusioonikoefitsiendid αS jaoks koacervaadi sees vastavalt FRAP-ile (nagu on kirjeldanud Kang et al. 35) on D = 0,013 ± 0,009 µm2/s ja D = 0,026 ± 0,008 µm2/s αS/Tau4-ΔN puhul αS/ süsteem.pLK, Tau ja D = vastavalt 0,18 ± 0,04 µm2/s (joonis 3c).Kuid difusioonikoefitsient αS on hajutatud faasis mitu suurusjärku kõrgem kui kõik kondenseerunud faasid, mis on määratud fluorestsentskorrelatsioonispektroskoopiaga (FCS, vt lisajoonis 3) samadel tingimustel (LLPS puhver), kuid polükatioonide puudumisel (D = 8 ± 4 µm2/s).Seetõttu väheneb αS translatsiooni kineetika koatservaatides võrreldes hajutatud faasi valkudega märkimisväärselt molekulaarsete väljatõrjumise mõjude tõttu, kuigi erinevalt tau faasist säilitavad kõik koatservaadid esimese poole tunni jooksul pärast moodustumist vedelikutaolised omadused.kiirem kineetika pLK kondensaadis.
a–c FRAP analüüs αS dünaamika kohta (2% AF488-ga märgistatud αS) elektrostaatilistes koatservaatides.αS / Tau441 FRAP testide tüüpilised kujutised kolmes eksemplaris on näidatud punktis (a), kus punased ringid näitavad värvitustatud alasid.Skaalariba on 5 µm.b Keskmised FRAP-kõverad ja (c) arvutatud difusioonikoefitsiendid (D) 5–6 (N) erineva tilga jaoks kolmest katsest, kasutades 100 µM αS ja Tau441 (punane) või ΔNt-Tau (sinine) või pLK (roheline) ekvimolaarseid kontsentratsioone. kümnekordse LLPS-i kontsentratsiooniga.FRAP-kõvera standardhälve on näidatud varjutatud värviga.Võrdluseks määrati hajutatud faasi difusioonikoefitsient αS kolmes korduses, kasutades fluorestsentskorrelatsioonispektroskoopiat (FCS) (lisateabe saamiseks vt lisajoonist 3 ja meetodeid).d 100 μM TEMPOL-122-αS pidevad X-riba EPR spektrid LLPS puhvris ilma polükatioonita (must) või 100 μM Tau441 (punane) või ΔNt-Tau (sinine) või 1 mM pLK (roheline) juuresolekul.Sisend näitab suurendatud vaadet tugevatele väljajoontele, kus toimuvad kõige dramaatilisemad muutused.e 50 μM TEMPOL-122-αS sidumiskõverad erinevate polükatioonidega LLPS-i puudumisel (PEG puudub).On näidatud, et III riba vähendatud amplituud võrreldes normaliseeritud EPR-spektri ribaga II (IIII/III) suurendab Tau441 (punane), ΔNt-Tau (sinine) ja pLK (roheline) molaarsuhteid.Värvilised jooned näitavad andmete sobivust, kasutades jämedat sidumismudelit, mille igal kõveral on n identset ja sõltumatut sidumissaiti.Toorandmed esitatakse algandmefailide kujul.
Täiendusena uurisime αS dünaamikat erinevates koacervaatides, kasutades suunatud spin-märgistust (SDSL) ja pidevat elektronide paramagnetilist resonantsi (CW-EPR).See meetod on osutunud väga kasulikuks IDP paindlikkuse ja dünaamika teatamisel realistliku jääkeraldusvõimega 36, ​​37, 38.Selleks konstrueerisime üksikutes Cys mutantides tsüsteiinijäägid ja kasutasime 4-hüdroksü-2,2,6,6-tetrametüülpiperidiin-N-oksüüli (TEMPOL) spin-sondi.Maleimiidi derivaadid märgistavad neid.Täpsemalt sisestasime TEMPOLi sondid positsioonile 122 või 24 αS (TEMPOL-122-αS ja TEMPOL-24-αS).Esimesel juhul sihime valgu C-terminaalset piirkonda, mis osaleb interaktsioonis polükatioonidega.Selle asemel võib positsioon 24 anda meile teavet kondensaadi valkude üldise dünaamika kohta.Mõlemal juhul vastasid hajutatud faasi valkude jaoks saadud EPR signaalid kiiresti liikuvas olekus nitroksiidi radikaalidele.Pärast faaside eraldamist tau või pLK juuresolekul (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 või ΔNt-Tau vahekorras 1:1 või pLK vahekorras 1:10) täheldati suhtelise piigi intensiivsuse suurenemist αS EPR-spekter.Kadumisjoon laienes, mis näitab tilkades αS ümberorienteerumise kineetikat, võrreldes lahjendatud faasis oleva valguga (joonis 3d, täiendav joonis 4a).Need muutused on rohkem väljendunud positsioonis 122. Kui asendis 24 ei mõjutanud pLK olemasolu sondi kineetikat, siis positsioonis 122 muutus spektraaljoone kuju oluliselt (täiendav joonis 4a).Kui proovisime modelleerida kahe αS / polükatioonisüsteemi positsioonis 122 asuvaid spektreid, kasutades isotroopset mudelit (täiendav joonis 5a), mida tavaliselt kasutatakse spin-märgistatud IDP38, 39 dünaamika kirjeldamiseks, ei suutnud me eksperimentaalseid spektreid rekonstrueerida..24 spinni kontrasti positsiooni spektraalne simulatsioon (täiendav joonis 5a).See viitab sellele, et polükatioonide juuresolekul on αS C-terminaalse piirkonna spin-konfiguratsioonide ruumis eelistatud positsioonid.Arvestades αS fraktsiooni kondenseeritud faasis eksperimentaalsetes EPR tingimustes (84 ± 2%, 79 ± 7% ja 47 ± 4% vastavalt αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau ja αS / pLK puhul - vaadake lisa). Andmeanalüüsi c) joonisel fig 2e on näha, et EPR-meetodiga tuvastatud laienemine peegeldab peamiselt αS C-terminaalse piirkonna interaktsiooni kondenseerunud faasis erinevate polükatioonidega (peamine muutus TEMPOL-122- kasutamisel αS), mitte valgu kondenseerumist.Sondis täheldatakse mikroviskoossuse suurenemist.Nagu oodatud, taastus valgu EPR-spekter muudes tingimustes kui LLPS täielikult, kui segule lisati 1 M NaCl (täiendav joonis 4b).Üldiselt näitavad meie andmed, et CW-EPR abil tuvastatud muutused peegeldavad peamiselt αS C-terminaalse piirkonna interaktsiooni kondenseerunud faasis erinevate polükatioonidega ja see interaktsioon näib olevat tugevam pLK-ga kui Tau-ga.
Koatservaadis olevate valkude kohta rohkem struktuurse teabe saamiseks otsustasime uurida LLPS-süsteemi, kasutades lahuses NMR-i.Siiski saime tuvastada ainult hajutatud faasi jäänud αS-fraktsiooni, mis võib olla tingitud valgu dünaamika vähenemisest koacervaadi sees ja tihedast faasist lahuse põhjas NMR-analüüsis.Kui analüüsisime LLPS proovi dispergeeritud faasi jäänud valgu struktuuri ja dünaamikat NMR abil (täiendav joonis 5c, d), märkasime, et valk käitus pLK ja ΔNt-Tau juuresolekul peaaegu identselt. mis olid valgu selgroo sekundaarses struktuuris ja dünaamikas, selgus sekundaarse keemilise nihke ja R1ρ lõdvestamise katsetes.NMR-andmed näitavad, et αS-i C-ots kaotab oluliselt konformatsioonilise paindlikkuse, säilitades samal ajal oma ebakorrapärase olemuse, nagu ka ülejäänud valgujärjestus, tänu selle interaktsioonidele polükatioonidega.
Kuna TEMPOL-122-αS kondenseerunud faasis täheldatud CW-EPR signaali laienemine peegeldab valgu interaktsiooni polükatioonidega, teostasime EPR tiitrimise, et hinnata αS seondumisafiinsust erinevate polükatioonidega LLPS puudumisel (ei akumuleerunud Puhver LLPS), mis viitab sellele, et koostoimed on lahjendatud ja kontsentreeritud faasides samad (mida kinnitavad meie andmed, täiendav joonis 4a ja täiendav joonis 6).Eesmärk oli näha, kas kõik koatservaadid, hoolimata nende ühistest vedelikutaolistest omadustest, näitavad molekulaarsel tasemel diferentsiaalset käitumist.Ootuspäraselt laienes EPR-spekter polükatioonide kontsentratsiooni suurenemisega, peegeldades molekulaarse paindlikkuse vähenemist kõigi interaktsioonipartnerite molekulaarsete interaktsioonide tõttu peaaegu küllastumiseni (joonis 3e, täiendav joonis 6).pLK saavutas selle küllastuse madalama molaarsuhtega (polükatioon: αS) võrreldes ΔNt-Tau ja Tau441-ga.Tegelikult näitas andmete võrdlemine ligikaudse sidumismudeliga, eeldades n identset ja sõltumatut sidumissaiti, et pLK näiv dissotsiatsioonikonstant (~5 μM) on suurusjärgu võrra madalam kui Tau441 või ΔNt-Tau (~50 μM) oma. ).uM).Kuigi see on ligikaudne hinnang, viitab see sellele, et αS-l on suurem afiinsus lihtsamate, pidevate positiivse laengupiirkondadega polükatioonide suhtes.Arvestades seda erinevust afiinsuses αS ja erinevate polükatioonide vahel, oletasime, et nende vedelad omadused võivad aja jooksul muutuda erinevalt ja seega kannatada erinevate LSPT protsesside all.
Arvestades valgu koatservaadi väga rahvarohket keskkonda ja valgu amüloidset olemust, jälgisime võimalike LSPT protsesside tuvastamiseks aja jooksul koatservaadi käitumist.Kasutades BF- ja CF-mikroskoopiat (joonis 4), täheldasime, et αS / Tau441 koatserveerub lahuses suurel määral, moodustades suured tilgad, mis puutuvad kokku ja niisutavad kaevu / slaidi põhjas olevat pinda täispiiskadena, nagu oodatud (täiendav joonis 4). 7d);me nimetame neid põhjast moodustunud struktuure "valguparvedeks".Need struktuurid jäid vedelaks, kuna säilitasid sulamisvõime (täiendav joonis 7b) ja neid võis näha mitu tundi pärast LLPS-i käivitamist (joonis 4 ja täiendav joonis 7c).Täheldasime, et märgamisprotsessi eelistatakse pigem hüdrofiilsete kui hüdrofoobsete materjalide pinnal (täiendav joonis 7a), nagu eeldatakse tasakaalustamata laengute ja seega kõrge elektrostaatilise pinnapotentsiaaliga elektrostaatiliste koacervaatide puhul.Nimelt vähenes märkimisväärselt αS/ΔNt-Tau ühinemine ja rafting, samas kui αS/pLK kondensaadid vähenesid oluliselt (joonis 4).Lühikese inkubatsiooniaja jooksul suutsid αS / pLK tilgad ühineda ja hüdrofiilset pinda niisutada, kuid see protsess peatus kiiresti ja pärast 5-tunnist inkubeerimist täheldati ainult piiratud ühinemissündmusi ja märgumist.– geel-tilguti üleminek.
Tüüpilised BF (halliskaala paneelid) ja CF (parempoolsed paneelid, AF488-märgisega αS roheliselt) koatservaadi proovidest, mis sisaldavad 100 µM αS (1% fluorestseeruv märgis) LLPS puhvris 100 µM Tau441 (ülemine) fluorestsentspiltide juuresolekul. -Tau (keskel) või 1 mM pLK (alumine) erinevatel inkubatsiooniaegadel ja fookuskõrgustel (z, kaugus plaadi süvendi põhjast).Katseid korrati 4-6 korda üksteisest sõltumatult samade tulemustega.αS/Tau441 koatservaadid niisutatakse 24 tunni pärast, moodustades pildil olevast suuremad parved.Kõigi piltide mastaabiriba on 20 µm.
Seejärel küsisime, kas αS / Tau441 LLPS-is moodustunud suured vedelikutaolised valgukogumid viivad mõne uuritud valgu amüloidi agregatsioonini.Järgisime αS/Tau441 tilkade küpsemist aja jooksul WF mikroskoopiaga samadel tingimustel nagu ülal, kuid kasutasime 1 µM AF488-ga märgistatud αS ja Atto647N-märgistatud Tau441 (joonis 5a).Nagu oodatud, täheldasime valgu täielikku lokaliseerumist kogu küpsemisprotsessi vältel.Huvitaval kombel alates ca.5 tunni pärast täheldati parvede sees intensiivsemaid mitteringikujulisi struktuure, mida me nimetasime "punktideks", millest mõned olid kolokaliseerunud αS-ga ja mõned rikastati Tau441-ga (joonis 5a, valged nooled).Neid laike on parvedes αS/ΔNt-Tau puhul alati suuremal määral täheldatud kui αS/ΔNt-Tau puhul.Sulandumiseks / niisutamiseks ebakompetentsete pLK ja Tau süsteemide tilkades ei olnud selgeid laike.Et testida, kas need αS ja Tau441 sisaldavad plekid on amüloiditaolised agregaadid, viisime läbi sarnase katse, kasutades CF-mikroskoopiat, milles Tau441 märgistati Atto647N-ga ja algusest peale lisati 12,5 µM amüloidispetsiifilist tioflaviin-T (ThT).värvaine.Kuigi αS/Tau441 tilkade või parvede ThT-värvimist ei täheldatud isegi pärast 24-tunnist inkubeerimist (joonis 5b, ülemine rida – ülejäänud tilgad valguparvede kohal), olid parve sees Atto647N-Tau441 sisaldavad ThT-positiivsed struktuurid väga nõrgad.see kordab eelnevalt kirjeldatud laikude suurust, kuju ja asukohta (joonis 5b, keskmine ja alumine rida), mis viitab sellele, et laigud võivad vastata amüloiditaolistele agregaatidele, mis on moodustunud vananeva vedeliku koatservaatides.
WF 25 μM αS erinevatel inkubatsiooniaegadel ja fookuskõrgustel (z, kaugus sidumata põhjast) 25 μM Tau441 (1 μM AF488-märgistatud αS ja Atto647N-märgistatud Tau441) juuresolekul mikroskoobi puhverplaadi süvendis koos LLPS-iga) .Kuus katset korrati sõltumatult sarnaste tulemustega.b CF-mikroskoopiline pilt 25 μM αS-st 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-märgistatud Tau441) ja 12,5 μM tioflaviin-T (ThT) juuresolekul.Kaalutud valgutilgad ja ladestunud valguparved ja laigud on näidatud vastavalt ülemises ja keskmises reas.Alumine rida näitab pilte parvedest ja kukkumistest kolmest sõltumatust koopiast.Valged nooled näitavad mõlemal paneelil ThT-positiivseid punkte.Kõigi piltide mastaabiriba on 20 µm.
Koatservaadi valguvõrgu muutuste üksikasjalikumaks uurimiseks vedelikult tahkele olekule üleminekul kasutasime fluorestsentsi eluaegset kujutist (FLIM) ja Försteri resonantsenergia ülekandemikroskoopiat (FRET) (joonis 6 ja täiendavad joonised 8 ja 9).Eeldasime, et kihi koatservaadi küpsemine kondenseeritumaks või isegi tahkeks agregeeritud valgustruktuuriks viib tihedama kontakti valgu ja selle külge kinnitatud fluorestsentssondi vahel, mis võib tekitada summutava efekti, mis väljendub sondi lühenenud elueas (τ) , nagu eelnevalt kirjeldatud40.,41,42.Lisaks võib topeltmärgistatud proovide puhul (vastavalt AF488 ja Atto647N FRET-i doonor- ja aktseptorvärvidena) selle τ-i vähenemisega kaasneda ka koacervaadi kondenseerumine ja FRET(E) efektiivsuse suurenemine LSPT ajal.Jälgisime parve ja laikude moodustumist aja jooksul LLPS αS/Tau441 ja αS/ΔNt-Tau proovides (25 µM igast valgust LLPS puhvris, mis sisaldas 1 µM AF488 märgistatud αS ja/või Atto647N märgistatud Tau441 või ΔNt-Tau).Täheldasime üldist suundumust, et AF488 (τ488) ja Atto647N (τ647N) sondide fluorestsentsi eluiga vähenes veidi, kui koatservaadid küpsesid (joonis 6 ja täiendav joonis 8c).Huvitaval kombel suurenes see muutus märkimisväärselt parvedes olevate punktide puhul (joonis 6c), mis näitab, et punktides toimus edasine valgu kondenseerumine.Selle toetuseks ei täheldatud 24 tundi vananenud αS / ΔNt-Tau tilkade puhul olulisi muutusi fluorestsentsi elueas (täiendav joonis 8d), mis viitab sellele, et tilkade geelistumine on määrimisest erinev protsess ja sellega ei kaasne olulist molekulaarset ümberkorraldamist. koacervaatide sees.Tuleb märkida, et punktidel on αS-s erinev suurus ja muutuv sisaldus, eriti αS / Tau441 süsteemi puhul (täiendav joonis 8e).Punktfluorestsentsi eluea vähenemisega kaasnes intensiivsuse suurenemine, eriti Atto647N märgistatud Tau441 puhul (täiendav joonis 8a), ja suurem FRET-i efektiivsus nii αS / Tau441 kui ka αS / ΔNt-Tau süsteemide puhul, mis näitab edasist kondenseerumist LLPS-is viis tundi. pärast vallandamist kondenseerusid staatilise elektri sees olevad valgud.Võrreldes αS / ΔNt-Tau-ga täheldasime αS / Tau441 täppides madalamaid τ647N ja mõnevõrra kõrgemaid τ488 väärtusi, millega kaasnesid madalamad ja ebahomogeensemad FRET väärtused.Võimalik, et see võib olla seotud asjaoluga, et αS / Tau441 süsteemis on täheldatud ja eeldatav αS arvukus agregaatides Tau-ga võrreldes heterogeensem, sageli substöhhiomeetriline, kuna Tau441 ise võib samuti läbida LLPS-i ja agregatsiooni (täiendav joonis 8e) .Piiskade ühinemise aste, parve moodustumine ja, mis kõige tähtsam, valkude agregatsioon vedelikutaolistes koacervaatides on aga maksimaalne, kui esinevad nii Tau441 kui ka αS.
αS/Tau441 ja αS/ΔNt-Tau eluaegne fluorestsentsmikroskoopia (FLIM) kujutised 25 µM iga valgu juures (1 µM AF488-ga märgistatud αS ja 1 µM Atto647N-märgistatud Tau441 või ΔNt-PSTa buffer) in.Veergud näitavad LLPS-i proovide tüüpilisi pilte erinevatel küpsemisaegadel (30 min, 5 h ja 24 h).Punane raam näitab piirkonda, mis sisaldab αS / Tau441 laike.Eluiga näidatakse värviribadena.Skaalariba = 20 µm kõigi piltide puhul.b Valitud ala sissesuumitud FLIM-pilt, mis on näidatud paneeli a punases kastis.Eluiga on näidatud sama värviskaalaga nagu paneelil a.Skaalariba = 5 µm.c Histogrammid, mis näitavad AF488 (kinnitatud αS-ga) või Atto647N (kinnitatud Tau külge) erinevate valguliikide jaoks (tilgad-D-, parv-R- ja täpp-P), mis on tuvastatud αS- jaoks salvestatud FLIM-piltidel) Tau441 ja Tau441 jaotuse ajajaotuse eluiga. αS/ΔNt-Tau koatservaadi proovid (N = 17-32 ROI D jaoks, 29-44 ROI R ja 21-51 ROI punktide puhul).Keskmised ja mediaanväärtused on näidatud vastavalt kollaste ruutude ja mustade joontena kastide sees.Kasti alumine ja ülemine piir tähistavad vastavalt esimest ja kolmandat kvartiili ning 1,5-kordse kvartiilivahemiku (IQR) minimaalsed ja maksimaalsed väärtused on näidatud vurrudena.Kõrvalekalded on näidatud mustade teemantidena.Statistiline olulisus jaotuspaaride vahel määrati kahe valimiga t-testi abil, eeldades ebavõrdseid dispersioone.Kahepoolse t-testi p-väärtused on näidatud tärnidega iga võrreldavate andmete paari kohta (* p-väärtus > 0,01, ** p-väärtus > 0,001, *** p-väärtus > 0,0001, **** p-väärtus > 0,00001), ns Tähistab ebaolulisust (p-väärtus > 0,05).Täpsed p väärtused on toodud täiendavas tabelis 1 ja algandmed on esitatud töötlemata andmefailidena.
Et veelgi demonstreerida täppide / agregaatide amüloiditaolist olemust, töödeldi värvimata koatservaadi proove 24 tundi kõrge kontsentratsiooniga (1 M) NaCl, mille tulemuseks oli agregaatide eraldamine valgu koatservaatidest.Kui isoleeritud agregaate (st agregaatide hajutatud lahust) vaadeldi aatomjõumikroskoopia (AFM) abil, täheldasime valdavalt sfäärilist morfoloogiat korrapärase kõrgusega umbes 15 nm, mis kipub assotsieeruma kõrge soolakontsentratsiooni tingimustes, sarnaselt tüüpiliste amüloidfibrillide käitumine, mis on tingitud tugevast hüdrofoobsest mõjust pinnale (pange tähele, et fibrillide kõrgus on tavaliselt ~ 10 nm) (täiendav joonis 10a).Huvitav on see, et kui isoleeritud agregaate inkubeeriti ThT-ga standardses ThT fluorestsentsanalüüsis, täheldasime ThT fluorestsentsi kvantsaagise dramaatilist suurenemist, mis on võrreldav sellega, mida täheldati siis, kui värvainet inkubeeriti tüüpiliste αS amüloidfibrillidega (täiendav joonis 10b), mis viitab sellele, et koacervaadi agregaadid sisaldavad amüloiditaolisi struktuure..Tegelikult olid agregaadid tolerantsed kõrge soolakontsentratsiooni suhtes, kuid tundlikud 4 M guanidiinkloriidi (GdnHCl) suhtes, nagu tüüpilised amüloidfibrillid (täiendav joonis 10c).
Järgmisena analüüsisime agregaatide koostist ühe molekuli fluorestsentsi, spetsiifilise fluorestsentskorrelatsiooni / ristkorrelatsiooni spektroskoopia (FCS / FCCS) ja kahevärvilise kokkulangevuse tuvastamise (TCCD) analüüsi abil.Sel eesmärgil eraldasime agregaadid, mis tekkisid pärast 24-tunnist inkubeerimist 100 μl LLPS proovides, mis sisaldasid αS ja Tau441 (mõlemad 25 μM) koos 1 μM AF488-märgistatud αS ja 1 μM Atto647N-märgisega Tau441.Lahjendage saadud dispergeeritud agregaadi lahus monomolekulaarsesse olekusse, kasutades sama PEG-vaba puhvrit ja 1 M NaCl-d (sama puhvrit, mida kasutatakse agregaatide eraldamiseks koatservaadist), et vältida võimalikke elektrostaatilisi interaktsioone LLPS-i ja valgu vahel.Üksiku molekuli ajatrajektoori näidet on näha joonisel 7a.FCCS/FCS analüüs (ristkorrelatsioon, CC ja autokorrelatsioon, AC) näitas, et αS-i ja tau-d sisaldavaid agregaate oli proovides rohkesti (vt CC kõverat joonisel 7b, vasak paneel) ning monomeerse jääkvalgu liig tekkis proovides. lahjendusprotsessi tulemus (vt vahelduvvoolu kõveraid joonisel 7b, vasak paneel).Kontrollkatsed, mis viidi läbi samades lahuse tingimustes, kasutades proove, mis sisaldasid ainult monomeerseid valke, ei näidanud CC kõveraid ja AC kõverad sobivad hästi ühekomponendilise difusioonimudeliga (võrrand 4), kus monomeersete valkude eeldatavad difusioonikoefitsiendid (joonis 7b) ), parem paneel).Agregeerunud osakeste difusioonikoefitsient on alla 1 µm2/s ja monomeersete valkude difusioonikoefitsient on umbes 1 µm2/s.50–100 µm/s;väärtused on sarnased eelnevalt avaldatud väärtustega ultraheliga töödeldud αS amüloidfibrillide ja monomeerse αS jaoks eraldi sarnastes lahuse tingimustes44.Kui analüüsisime agregaate TCCD plahvatusanalüüsiga (joonis 7c, ülemine paneel), leidsime, et igas eraldatud agregaadis (αS/Tau heteroagregaat) sisaldas umbes 60% tuvastatud agregaatidest nii αS kui ka tau, umbes 30% ainult tau, ainult umbes 10% αS.αS/Tau heteroagregaatide stöhhiomeetriline analüüs näitas, et enamik heteroagregaate oli tau-ga rikastatud (stöhhiomeetria alla 0,5, keskmine tau molekulide arv agregaadi kohta on 4 korda suurem kui αS molekulide puhul), mis on kooskõlas meie tööga, mida täheldati FLIM-is in situ. katsed..FRET-analüüs näitas, et need agregaadid sisaldasid mõlemat valku, kuigi tegelikud FRET-i väärtused ei oma sel juhul suurt tähtsust, kuna fluorofooride jaotus igas agregaadis oli juhuslik, kuna katses kasutati märgistamata valku.Huvitav on see, et kui tegime sama analüüsi, kasutades 45, 46 küpse amüloidi agregatsiooni puuduliku Tau varianti (vt lisajoonis 11a, b), märkasime, et kuigi αS elektrostaatiline agregatsioon oli sama (täiendav joonis 11c, d), võime moodustada agregaate koatservaadis vähenes drastiliselt ja FLIM tuvastas in situ katsetes mitmeid kohti ning eraldatud koondproovide puhul täheldati nõrku ristkorrelatsioonikõveraid.Väikese arvu tuvastatud agregaatide puhul (ainult kümnendik Tau441-st) täheldasime aga, et iga agregaat oli rikastatud αS-ga kui see Tau variant, kusjuures ligikaudu 50% tuvastatud agregaatidest sisaldas ainult αS-molekule ja αS oli heterogeenne. .agregaadid (vt täiendav joonis 11e), erinevalt Tau441 genereeritud heterogeensetest agregaatidest (joonis 6f).Nende katsete tulemused näitasid, et kuigi αS ise on võimeline akumuleeruma koacervaadis koos tauga, on tau tuuma moodustumine nendes tingimustes soodsam ja saadud amüloiditaolised agregaadid on võimelised toimima αS ja tau vormina.Kui aga on moodustunud tau-rikas tuum, eelistatakse αS ja tau heterotüüpseid interaktsioone agregaatides tau-molekulide vaheliste homotüüpsete interaktsioonide asemel;jälgime ka valguvõrke vedelates αS / tau koatservaatides.
αS / Tau441 elektrostaatilistes koatservaatides moodustunud isoleeritud agregaatide üksikute molekulide tüüpilised fluorestsentsi ajalised jäljed.αS / Tau441 koondumisagregaatidele vastavaid purunemisi (pursked üle näidatud läve) täheldati kolmes tuvastuskanalis (AF488 ja Atto647N emissioon pärast otsest ergastamist, sinine ja punane joon, Atto647N emissioon pärast kaudset ergastamist), FRET, violetne joon).b LLPS-st saadud isoleeritud αS/Tau441 agregaatide proovi FCS/FCCS analüüs (vasak paneel).Autokorrelatsiooni (AC) kõverad AF488 ja Atto647N jaoks on näidatud vastavalt sinise ja punasena ning mõlemat värvainet sisaldavate agregaatidega seotud ristkorrelatsiooni (CC) kõverad on näidatud lillana.AC kõverad peegeldavad märgistatud monomeersete ja agregeeritud valguliikide olemasolu, samas kui CC kõverad näitavad ainult topeltmärgistatud agregaatide difusiooni.Sama analüüs, kuid samades lahuse tingimustes nagu isoleeritud kohtades, on parempoolsel paneelil kontrollidena näidatud proovid, mis sisaldavad ainult monomeerset αS ja Tau441.c αS/Tau441 elektrostaatilistes koatservaatides moodustunud isoleeritud agregaatide üksikute molekulide fluorestsents-kiiranalüüs.Teave iga neljas erinevas korduses (N = 152) leitud agregaadi kohta joonistatakse nende stöhhiomeetria, S väärtuste ja FRET-i efektiivsuse alusel (ülemine paneel, värviriba kajastab esinemist).Eristada saab kolme tüüpi agregaate: -aS-agregaadid ainult S~1 ja FRET~0-ga, Tau-ainult agregaadid S~0 ja FRET~1-ga ning heterogeensed Tau/αS-agregaadid vahepealse S-i ja FRET-iga. Koguse hinnangud mõlemas heterogeenses agregaadis tuvastatud markervalgud (N = 100) on näidatud alumisel paneelil (värviskaala peegeldab esinemist).Toorandmed esitatakse algandmefailide kujul.
On teatatud, et vedelate valgukondensaatide küpsemine või vananemine aja jooksul geelitaolisteks või tahketeks struktuurideks on seotud kondensaadi mitmete füsioloogiliste funktsioonidega47, aga ka haigustega, mis on ebanormaalne protsess, mis eelneb amüloidi agregatsioonile 7, 48, 49. uurime üksikasjalikult faaside eraldamist ja käitumist.LSPT αS juhuslike polükatioonide juuresolekul kontrollitud keskkonnas madalate mikromolaarsete kontsentratsioonide ja füsioloogiliselt oluliste tingimustes (pange tähele, et αS arvutatud füsioloogiline kontsentratsioon on> 1 µM50), järgides LPS tüüpilist termodünaamiliselt juhitud käitumist.Leidsime, et αS, mis sisaldab füsioloogilise pH juures tugevalt negatiivselt laetud C-terminaalset piirkonda, suudab elektrostaatilise protsessi kaudu moodustada LLPS-i kaudu vesilahuses valgurikkaid tilku kompleksne kondensatsioon agregeeruvate makromolekulide juuresolekul.Sellel protsessil võib olla oluline mõju rakukeskkonnas, kus αS puutub kokku erinevate polükatioonsete molekulidega, mis on seotud selle haigusega seotud agregatsiooniga nii in vitro kui ka in vivo51, 52, 53, 54.
Paljudes uuringutes on valkude dünaamikat tilkades peetud üheks küpsemisprotsessi määravaks võtmeteguriks55, 56.Elektrostaatilistes αS koatservaatides polükatioonidega sõltub küpsemisprotsess ilmselt polükatioonidega interaktsiooni tugevusest, valentsist ja nende interaktsioonide paljususest.Tasakaaluteooria viitab sellele, et kahe vedela oleku tasakaalumaastikuks oleks LLPS-i juhtiva suure biopolümeeririkka tilga olemasolu57,58.Piiskade kasvu saab saavutada Ostwaldi küpsemise59, ühinemise60 või vaba monomeeri tarbimise teel hajutatud faasis61.αS ja Tau441, ΔNt-Tau või pLK puhul kontsentreeriti suurem osa valgust kondensaadis selles uuringus kasutatud tingimustes.Kuigi täissuuruses tau tilgad ühinesid pinna niisutamisel kiiresti, oli tilkade ühinemine ja märgumine ΔNt-Tau ja pLK jaoks raske, mis viitab vedeliku omaduste kiirele kadumisele nendes kahes süsteemis.Meie FLIM-FRET analüüsi kohaselt näitasid vanad pLK ja ΔNt-Tau tilgad samasugust valgu agregatsiooni taset (sarnane fluorestsentsi eluiga) kui algsed tilgad, mis viitab sellele, et esialgne valguvõrk säilis, ehkki jäigem.
Ratsionaliseerime oma katsetulemusi järgmise mudeliga (joonis 8).Algselt ajutiselt moodustunud tilgad on sageli ilma elektrostaatilise kompensatsioonita valguvõrgud ja seega on laengu tasakaalustamatuse piirkondi, eriti tilkade liideses, mille tulemuseks on kõrge elektrostaatilise pinnapotentsiaaliga tilgad.Laengu kompenseerimiseks (nähtust, mida tavaliselt nimetatakse valentsi kahanemiseks) ja tilkade pinnapotentsiaali minimeerimiseks võivad tilgad sisaldada uusi polüpeptiide lahjendatud faasist, korraldada ümber valguvõrke, et optimeerida laengu ja laengu interaktsioone, ja suhelda teiste tilkadega.pindadega (niisutamine).Tundub, et αS/pLK tilgad suudavad tänu oma lihtsamale valguvõrgustikule (ainult heterotüüpsed interaktsioonid αS ja pLK vahel) ja suuremale afiinsusele valgu-valgu interaktsioonide suhtes kiiremini kondensaadi laengut tasakaalustada;tõepoolest, me täheldasime algselt moodustatud αS / pLK koatservaatides kiiremat valgu kineetikat kui αS / Tau.Pärast valentsi ammendumist muutuvad interaktsioonid vähem lühiajaliseks ja tilgad kaotavad oma vedelad omadused ning muutuvad geelitaolisteks mittesüttivateks tilkadeks, millel on madal elektrostaatiline pinnapotentsiaal (ja seetõttu ei suuda pinda niisutada).Seevastu αS / Tau tilgad on tilkade laengu tasakaalu optimeerimisel vähem tõhusad keerukamate valguvõrkude (nii homotüüpse kui ka heterotüüpse interaktsiooniga) ja valkude interaktsioonide nõrgema olemuse tõttu.Selle tulemuseks on tilgad, mis säilitavad vedeliku käitumist pikema aja jooksul ja millel on kõrge elektrostaatiline pinnapotentsiaal, mida kipub minimeerima ühinemine ja kasvamine (minimeerides seega tilkade pindala/mahu suhet) ja hüdrofiilse pinnakeemia niisutamisega.See loob suured kontsentreeritud valgu raamatukogud, mis säilitavad vedeliku omadused, kuna interaktsioonid jäävad valguvõrgus laengu optimeerimise pideva otsimise tõttu väga mööduvaks.Huvitav on see, et Tau N-otsa kärbitud vormid, sealhulgas mõned looduslikult esinevad isovormid62, omavad vahepealset käitumist, kusjuures mõned vananevad koos αS-ga pikaealisteks geelitaolisteks tilkadeks, teised aga muutuvad suurteks vedelateks kondensaatideks.See αS elektrostaatiliste koatservaatide küpsemise kahesus on kooskõlas hiljutiste LLPS-i teoreetiliste ja eksperimentaalsete uuringutega, mis on tuvastanud korrelatsiooni valentsi kahanemise ja kondensaatide elektrostaatilise sõelumise vahel, mis on kondensaadi suuruse ja vedeliku omaduste kontrollimise võti.Mehhanism 58.61.
See skeem näitab oletatavat amüloidi agregatsiooni rada αS ja Tau441 jaoks LLPS ja LSPT kaudu.Täiendavate anioonirikaste (punaste) ja katiooniderikaste (siniste) piirkondadega on rahuldava valentsiga αS ja tau elektrostaatilistel koatservaatidel madalam pinnaenergia ja seetõttu väiksem ühinemine, mille tulemuseks on kiire tilkade vananemine.Saavutatakse stabiilne aglomeerimata geeli olek..Selline olukord on αS/pLK süsteemi puhul väga soodne tänu selle kõrgemale afiinsusele ja lihtsamale valgu-paari interaktsioonivõrgustikule, mis võimaldab kiiret geelilaadset üleminekut.Vastupidi, ebarahuldava valentsiga tilgad ja seetõttu interaktsiooniks saadaolevad valguga laetud piirkonnad hõlbustavad koatservaadil hüdrofiilse pinna sulandumist ja niisutamist, et vähendada selle kõrget pinnaenergiat.See olukord on eelistatavam αS / Tau441 koacervaatide puhul, millel on mitmevalentne kompleksvõrk, mis koosneb nõrkadest Tau-Tau ja αS-Tau interaktsioonidest.Suuremad koatservaadid säilitavad omakorda kergemini oma vedelikutaolised omadused, võimaldades teistel valkude ja valkude vastasmõjudel.Lõpuks moodustuvad koacervaadivedelikus amüloidi heterogeensed agregaadid, mis sisaldavad nii αS kui ka tau, mis võivad olla seotud inklusioonkehades leiduvate agregaatidega, mis on neurodegeneratiivsete haiguste tunnused.
Suured vedelikutaolised struktuurid, mis moodustuvad αS / Tau441 küpsemise ajal väga ülekoormatud, kuid dünaamilise valgukeskkonnaga ja vähemal määral αS / ΔNt-Tau koatservaatidega, on ideaalsed reservuaarid valkude agregatsiooni tuuma moodustamiseks.Oleme tõepoolest täheldanud tahkete valguagregaatide moodustumist seda tüüpi valgu koatservaatides, mis sisaldavad sageli nii αS kui ka tau.Oleme näidanud, et neid heteroagregaate stabiliseerivad mitteelektrostaatilised interaktsioonid, nad on võimelised siduma amüloidispetsiifilisi ThT värvaineid samamoodi nagu tüüpilised amüloidfibrillid ja neil on tõepoolest sarnane vastupidavus erinevatele mõjudele.Näidati, et LLPS-i moodustatud αS / tau agregaatidel on amüloiditaolised omadused.Tõepoolest, amüloidi agregatsiooni puuduliku Tau küps variant on nende heterogeensete αS agregaatide moodustumisel vedelas elektrostaatilises koatservaadis oluliselt kahjustatud.αS / Tau441 agregaatide moodustumist täheldati ainult koatservaatide sees, mis säilitasid vedelikutaolised omadused, ja mitte kunagi, kui koatservaadid / tilgad ei jõudnud geeli olekusse.Viimasel juhul takistab elektrostaatiliste interaktsioonide suurenenud tugevus ja sellest tulenevalt valguvõrgu jäikus valkude vajalikke konformatsioonilisi ümberkorraldusi, et luua uusi amüloidi tuumaks vajalikke valkude interaktsioone.Seda on aga võimalik saavutada paindlikumate, vedelikutaoliste koatservaatidega, mis omakorda jäävad suurema tõenäosusega vedelaks.
Asjaolu, et agregaatide moodustumine kondenseerunud faasis on eelistatavam suurtes αS / Tau kondensaatides kui väikestes tilkades, mis kiiresti geelistuvad, rõhutab tilkade ühinemist kontrollivate tegurite tuvastamise olulisust.Seega ei esine mitte ainult faaside eraldumise tendentsi, vaid ka kondensaadi suurust tuleb kontrollida nii nõuetekohaseks toimimiseks kui ka haiguste ennetamiseks58, 61.Meie tulemused rõhutavad ka LLPS ja LSPT vahelise tasakaalu tähtsust αS / Tau süsteemi jaoks.Kuigi tilkade moodustumine võib kaitsta amüloidi agregatsiooni eest, vähendades küllastustingimustes saadaolevate valgu monomeeride hulka, nagu on välja pakutud teistes süsteemides 63, 64, võib tilkade liitmine kõrgel tilgatasemel põhjustada valkude sisemist agregatsiooni aeglaste konformatsiooniliste ümberkorralduste kaudu.valguvõrgud..
Üldiselt rõhutavad meie andmed tugevalt sidusa valentsi ja rahulolevate / rahulolematute interaktsioonide olulisust tilkvõrkudes LSPT kontekstis.Eelkõige näitame, et täispikad αS / Tau441 kondensaadid on võimelised tõhusalt sulanduma ja tuumama, moodustades amüloiditaolisi heteroagregaate, mis sisaldavad mõlemat valku ja pakuvad meie katsetulemuste põhjal molekulaarset mehhanismi.Kahe valgu koosagregatsioon αS/Tau vedeliku koatservaadis, millest me siin teatame, võib tõepoolest olla seotud kahe valgu kaaslokaliseerumisega inklusioonides, mis on haiguse iseloomulikud tunnused ning mis võivad aidata mõista LLPS-i ja LLPS-i vahelist seost. amüloidi agregatsioon, sillutades teed kõrgelt laetud IDP-le neurodegeneratsioonis.
Monomeersed WT-αS, tsüsteiini mutandid (Q24C-αS, N122C-αS) ja ΔCt-αS variandid (Δ101-140) ekspresseeriti E. coli-s ja puhastati, nagu eelnevalt kirjeldatud.5 mM DTT lisati αS tsüsteiini mutantide puhastamise kõikidesse etappidesse, et vältida disulfiidsideme moodustumist.Tau441 isovorm (plasmiid saadud Addgene #16316-st), ΔNt-Tau variant (Δ1–150, saadud IVA kloonimisel praimeritega CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ja AggDEf-1,7CTa5 puhastatud variant (G-3A1,7CTTamer) E. coli kultuurid olid kasvatati OD600 = 0,6–0,7 temperatuuril 37 °C ja 180 pööret minutis ning ekspressioon indutseeriti IPTG-ga 3 tundi temperatuuril 37 °C.Koguge rakud 11 500 xg juures 15 minutit temperatuuril 4 °C ja peske soolapuhvriga, mis sisaldab 150 mM NaCl.Resuspendeerige pellet lüüsipuhvris (20 ml 1 L LB kohta: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, bensamidiin 50 µM,00 copeptin1M).Ultrahelitöötlus viidi läbi jääl amplituudiga 80% 10 impulsi jooksul (1 min sisse, 1 min välja).Ühe ultraheliga ei tohi ületada 60 ml.E. coli lüsaate kuumutati 95 °C juures 20 minutit, seejärel jahutati jääl ja tsentrifuugiti 127 000 x g juures 40 minutit.Selitatud supernatant kanti 3,5 kDa membraanile (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) ja dialüüsiti 4 L dialüüsipuhvriga (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0,1 mM) 10 tundi.5 ml katioonivahetuskolonn (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) tasakaalustati tasakaalustamispuhvriga (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lüsaat filtriti läbi 0,22 μm PVDF filtri ja süstiti kolonni voolukiirusega 1 ml/min.Elueerimine viidi läbi järk-järgult, tau elueeriti 15–30% elueerimispuhvriga (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Fraktsioone analüüsiti SDS-PAGE abil ja kõik fraktsioonid, mis sisaldasid ühte riba eeldatava tau molekulmassiga, kontsentreeriti 10 kDa tsentrifuugifiltri abil ja asendati puhvriga, mis sisaldas 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM ja DTT 2 mM. valgu lõplik kontsentratsioon oli 100 µM.Seejärel juhiti valgulahus läbi 0,22 μm PVDF-filtri, külmutati kiiresti ja säilitati temperatuuril -80 °C.Proteiini K18 pakkus lahkelt prof Alberto Boffi.Preparaadi puhtus oli >95%, nagu kinnitasid SDS-PAGE ja MALDI-TOF/TOF.Erinevad tsüsteiinid märgistati keemiliselt AlexaFluor488-maleimiidiga (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) või TEMPOL-maleimiidiga (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).kinnitasid neeldumine ja MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ja K18 märgistati natiivsete tsüsteiinijääkidega positsioonides 191 ja 322, kasutades Atto647N-maleimiidi (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Saksamaa), järgides sama protseduuri.αS ja Tau441 netotasu jäägi kohta loodi CIDER66 abil.
Tahke polü-L-lüsiin (pLK DP 90-110 vastavalt NMR-ile tarnijalt Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) lahustati 10 mM HEPES-is, 100 mM NaCl-s, pH 7,4 kuni 10 mM kontsentratsioonis, töödeldi ultraheliga 5 minutit ultraheli veevannis ja hoida temperatuuril -20°C.PEG-8, dekstraan-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ja FITC-dekstraan-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) on vees lahustuvad ja LLPS puhvris laialt levinud.Dialüüs eemaldab saastavad soolad.Seejärel filtreeriti need läbi süstalfiltri, mille pooride suurus oli 0, 22 μm, ja nende kontsentratsioonid arvutati refraktomeetri abil (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).LLPS proovid valmistati toatemperatuuril järgmises järjekorras: segati puhver ja ekstrusioon ning 1 mM tris(2-karboksüetüül)fosfiin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etaan- 1,2-diüüldinitriil) tetraäädikhape (EDTA, karboksünt) ja 1% proteaasi inhibiitori segu (PMSF 100 mM, bensimiid 1 mM, leupeptiin 5 μM).Seejärel lisatakse αS ja sulatatud polükatioonid (valikud pLK või Tau).Tioflaviin-T aegridade katsete jaoks (ThT, Carbosynth, Compton, UK) kasutage ThT üldkontsentratsiooni pooleks αS kontsentratsioonist.Homogeensuse tagamiseks segage proove õrnalt, kuid põhjalikult.Iga komponendi kontsentratsioon varieerus katseti, nagu on kirjeldatud jaotises Tulemused.Asiidi kasutati kontsentratsioonis 0,02% (mass/maht) alati, kui katse kestus ületas 4 tundi.Kõigi LLPS-proove kasutavate analüüside puhul laske segul enne analüüsimist 5 minutit tasakaalustuda.Valguse hajumise analüüsi jaoks laaditi 150 µl proove mittesiduvatele 96 süvendiga mikroplaatidele (µClear®, must, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) ja kaeti kleepuva kilega.LLP-sid jälgiti, mõõtes neeldumist 350 nm juures lahuse keskel CLARIOstar plaadilugejas (BMG Labtech, Ortenberg, Saksamaa).Katsed viidi läbi kolmes korduses temperatuuril 25 °C ja vead arvutati standardhälbena keskmisest.Lahjendatud faas kvantifitseeriti proovi tsentrifuugimise ja SDS-PAGE geelianalüüsiga ning αS-fraktsioon lahjendatud ja kontsentreeritud faasis kvantifitseeriti erinevates LLPS-i lahustes.100 μl LLPS proov, mis sisaldas 1 μM AF488-ga märgistatud αS, valmistati põhjaliku segamise teel, millele järgnes tsentrifuugimine 9600 × g juures 30 minutit, misjärel oli sade tavaliselt nähtav.Ülemist 50 μl supernatanti kasutati valgu kvantifitseerimiseks, kasutades SDS-PAGE geeli.Geele skaneeriti AF488 filtritega, kasutades ChemiDoc geelikuvamissüsteemi (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) või värviti Coomassie peitsiga ja visualiseeriti sobivate filtritega.Saadud ribasid analüüsiti ImageJ versiooni 1.53i (National Institutes of Health, USA) abil.Katsed viidi läbi kahes eksemplaris kahes erinevas katses sarnaste tulemustega.
Tavaliselt kanti 150 μl proove mittesiduvatele 96 süvendiga mikroplaatidele ja visualiseeriti toatemperatuuril Leica DMI6000B pöördmikroskoobiga (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksamaa).Kohtkatseteks kasutati ka µ-Slide Angiogenesis plaate (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Saksamaa) või 96 süvendiga polüstüreeni mikroplaate (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Valgusallikatena kasutati EL6000 halogeen- või elavhõbemetallhalogeniidlampe (vastavalt BF/DIC ja WF pildistamiseks).WF-mikroskoopia jaoks kasutati 40-kordse suurendusega õhuobjektiivi (Leica Microsystems, Saksamaa), et fokuseerida valgust proovile ja koguda see.AF488 ja ThT märgistusega proovide puhul filtreerige ergastus ja emissioon standardsete GFP filtrikomplektidega, ergastus- ja emissiooniribafiltrid, vastavalt 460–500 nm ja 512–542 nm ribapääsfiltrid ning 495 nm dikroiline peegel.Atto647N-ga märgistatud proovide jaoks kasutati standardset Cy5-filtrite komplekti ergastus- ja emissiooniribafiltritega vastavalt 628–40 nm ja 692–40 nm ning 660 nm dikroonset peeglit.BF- ja DIC-mikroskoopia jaoks kasutage sama peegeldunud valguse kogumise objektiivi.Kogutud valgus salvestati Leica DFC7000 CCD-kaameraga (Leica Microsystems, Saksamaa).Säriaeg oli 50 ms BF- ja DIC-mikroskoopilise pildistamise korral ning 20-100 ms WF-mikroskoopilise pildistamise korral.Võrdluseks oli kõigi ThT-ga tehtud katsete kokkupuuteaeg 100 ms.Piiskade ühinemise visualiseerimiseks viidi läbi aeglustatud katsed, kusjuures pilte koguti iga 100 ms järel mitme minuti jooksul.Pildianalüüsiks kasutati ImageJ-d (NIH, USA).Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris sarnaste tulemustega.
Kolokalisatsioonikatsete, FRAP-i ja 3D-rekonstrueerimise jaoks saadi kujutised Zeiss LSM 880 pööratud konfokaalse mikroskoobiga, kasutades ZEN 2 sinist väljaannet (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Saksamaa).50 µl proovid kanti µ-Slide Angiogenesis Petri tassidele (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Saksamaa), töödeldi hüdrofiilse polümeeriga (ibiTreat) ja paigaldati 63× õliimmersioonobjektiivi (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil). DIC-is).Pildid saadi 458 nm, 488 nm ja 633 nm argoonlaseri joontega eraldusvõimega 0,26 µm/piksli ja kokkupuuteajaga 8 µs/piksli ergastuse ja emissiooni tuvastamise aknad 470–600 nm, 493–628 nm. ja 638–755 nm kasutati vastavalt ThT, AF488 ja Atto647N visualiseerimiseks.FRAP-katsete jaoks salvestati iga proovi aeglustatud fotograafia kiirusega 1 kaader sekundis.Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris toatemperatuuril sarnaste tulemustega.Kõiki pilte analüüsiti tarkvara Zen 2 sinise väljaande abil (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Saksamaa).FRAP-kõverad normaliseeriti, joonistati ja sobitati intensiivsuse/aja andmetega, mis saadi piltidelt Zen 2 abil, kasutades OriginPro 9.1.Taastumiskõverad sobitati monoeksponentsiaalse mudeliga, et võtta arvesse molekulaarset difusiooni koos täiendava eksponentsiaalse terminiga, et võtta arvesse omandamise pleegitusefekti.Seejärel arvutasime D, kasutades nominaalset pleegitamisraadiust ja varem määratud taastumise poolestusaega, nagu Kangi jt võrrandis.5 35 näidatud.
αS üksikud tsüsteiinivariandid sünteesiti 4-hüdroksü-2,2,6,6-tetrametüülpiperidiin-N-oksüüliga (TEMPOL) positsioonides 24 (TEMPOL-24-αS) ja 122 (TEMPOL-122-αS), vastavalt.Spin-märgistamine EPR-katsete jaoks määrati αS kontsentratsioon 100 μM ja PEG kontsentratsioon oli 15% (mass/maht).Erinevate agregatsioonitingimuste korral oli αS:pLK suhe 1:10, samas kui αS:ΔNt-Tau ja αS:Tau441 suhe hoiti 1:1.Sidumistiitrimise katseteks tõrjumise puudumisel hoiti TEMPOL-122-αS 50 μM juures ja polükatioonid tiitriti kasvavatel kontsentratsioonidel, valmistades iga tingimuse eraldi.CW-EPR mõõtmised viidi läbi Bruker ELEXSYS E580 X-riba spektromeetriga, mis oli varustatud Bruker ER4118 SPT-N1 resonaatoriga, mis töötas mikrolaine (SHF) sagedusel ~9,7 GHz.Temperatuur seati 25 °C-ni ja seda kontrolliti vedela lämmastiku krüostaadiga.Spektrid saadi küllastumata tingimustes MW võimsusel 4 mW, modulatsiooni amplituudil 0,1 mT ja modulatsioonisagedusel 100 kHz.Spektri intensiivsused normaliseeriti, et vältida erinevusi proovide vahel spinkontsentratsioonides ja võimalikku tsentrifuugimise vähenemist, mis on tingitud redutseerivate ainete jääkkontsentratsioonidest Tau441 või ΔNt-Tau (esinevates algsetes valgulahustes) sisaldavates proovides.Antud g väärtused saadi EPR spektraalmodelleerimise tulemusena, mis viidi läbi tarkvaraga Easyspin (v. 6.0.0-dev.34), mis on realiseeritud Matlab®67-s.Andmete modelleerimiseks kasutati ühe-/kahekomponendilisi isotroopseid mudeleid.Pärast kõigi signaalide normaliseerimist arvutati jäägid, lahutades iga simulatsiooni vastavast katsespektrist.Seondumistiitrimise analüüsi jaoks kasutati polükatioonide αS-ga seondumise jälgimiseks kolmanda riba suhtelist intensiivsust normaliseeritud EPR-spektri teise riba suhtes (IIII/III).Dissotsiatsioonikonstandi (Kd) hindamiseks sobitati saadud kõver ligikaudse mudeliga, mis eeldas n identset ja sõltumatut sidumissaiti.
NMR-spektroskoopia katsed viidi läbi Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR-spektromeetriga, mis oli varustatud krüosondi ja Z-gradiendiga.Kõik katsed viidi läbi, kasutades 130–207 uM αS ja vastavaid αS/ΔNt-Tau ja pLK ekvivalente 10 mM HEPES-s, 100 mM NaCl-s, 10% DO-s, pH 7,4 ja viidi läbi temperatuuril 15 °C.LPS-i jälgimiseks NMR abil lisati eelnevalt segatud proovidele 10% PEG.Keemilise nihke häiringu graafik (joonis 1b) näitab keskmisi 1H ja 15N keemilisi nihkeid.αS 2D1H-15N HSQC spektrid määrati eelmise määramise põhjal (BMRB kirje #25227) ja kinnitati HNCA, HNCO ja CBCAcoNH 3D-spektrite salvestamise ja analüüsimisega.13Cα ja 13Cβ keemilised nihked arvutati ΔNt-Tau või pLK juuresolekul, et mõõta võimalikke muutusi sekundaarstruktuuri suundumustes võrreldes αS keemiliste nihketega puhta juhusliku mähise konformatsioonis 68 (täiendav joonis 5c).R1ρ sagedusi mõõdeti hsqctretf3gpsi katsete salvestamisega (saadud Brukeri raamatukogust) viivitusega 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 ja 800 ms ning eksponentsiaalseid funktsioone kohandati vastavalt tipptaseme viivitustele erineva intensiivsusega. korda, et määrata R1ρ ja selle katseline määramatus.
Kahevärvilised ajalahutusega fluorestsentsmikroskoopilised katsed viidi läbi kaubandusliku ajalahutusega MT200 fluorestsentskonfokaalse mikroskoobiga (PicoQuant, Berliin, Saksamaa) koos ajakorrelatsiooniga üksiku footonite loendusseadmega (TCSPC).Laserdioodi pead kasutatakse impulss-interleaved excitation (PIE) jaoks, kiir läbib ühemoodilist lainejuhti ja on häälestatud laseri võimsusele 10 kuni 100 nW 481 nm ja 637 nm laserjoonte jaoks, mõõdetuna pärast dikrootilist peeglit.See tagab optimaalse footonite loendamise kiiruse, vältides footonite aliase, fotopleegitamise ja küllastumise mõju.μ-Slide angiogeneesi katteklaasid või plaadid (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Saksamaa) asetati otse sukeldumisvette Super Apochromat 60x NA 1.2 läätse kohale, millel oli korrigeeriv krae (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Peakiire jaoturina kasutati 488/640 nm dikroilist peeglit (Semrock, Lake Forest, IL, USA).Fokuseerimata kiirgus blokeeritakse 50 mikronise läbimõõduga auguga, seejärel jagatakse fokusseeritud kiirgus 50/50 kiirejaoturi abil 2 tuvastamisteeks.Detektori ees kasutati ribapääsu emissioonifiltreid (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 rohelise värvi (AF488) ja 690/70 punase värvi jaoks (Atto647N).Detektoridena kasutati ühe fotoni laviini dioode (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Itaalia).Nii andmete kogumine kui analüüs viidi läbi, kasutades kaubanduslikult saadavat SymphoTime64 tarkvara (PicoQuant GmbH, Berliin, Saksamaa).
Viiskümmend mikroliitrit LLPS proove kanti μ-Slide'i angiogeneesi süvenditesse (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Saksamaa).Saadud kujutised teravustatakse 20 µm kõrgusele kaevu põhjast, et saavutada optimaalne objektiivi töökaugus hõljuvate tilkade puhul ning ~1 µm parvede ja punktide puhul, mille aksiaalne eraldusvõime on vähemalt 0,25 µm/piksel ja viiteaeg 400 µs/piksli kohta.Valige andmed, rakendades iga kanali keskmisel taustsignaali intensiivsusel (PBG, keskmine + 2σ) põhinevat intensiivsuse läve, nii et valitakse ainult vedelad valgupiisad, parved või laigud, filtreerides välja hajutatud faasi võimalikud lähtekohad.Iga kanali iga liigi (τ) eluea analüüsimiseks (roheline, "g" AF488 ja punane, "r" Atto647N jaoks) valisime huvipakkuvad piirkonnad (ROI), mis sisaldavad tilka, parve või laike (täiendav joonis 1). ).8b) ja tuletasid need, sobitades igas kanalis nende eluea lagunemise (τD, τR ja τP tilkade, parvede või täppide jaoks, vt lisajoonis 8c), kasutades saba sobivuse analüüsi ja kahekomponendilist lagunemismudelit.Keskmine τ alates τ .Analüüsist jäeti välja ROI-d, mis tekitasid mitme eksponentsiaalse sobivuse jaoks liiga vähe footoneid.Kasutatud piirväärtus oli <104 footoni parvede ja punktide jaoks ning 103 tilkade jaoks.Piiskadel on madalam lävi, kuna suurema intensiivsusega väärtusega lagunemiskõveraid on raske saada, kuna pildiväljas olevad tilgad on tavaliselt väiksemad ja arvukamad.Analüüsimiseks jäeti kõrvale ka ROI-d, mille footonite arv ületas footonite akumulatsiooni piiri (seatud väärtusele >500 loendit piksli kohta).Sobitage huvipakkuvast piirkonnast saadud intensiivsuse vähenemise kõver intensiivsusega 90% maksimumist (veidi pärast vaibumise maksimaalset intensiivsust) kasutusea algusest, et tagada minimaalsed IRF-häired, säilitades samal ajal kogu intensiivsuse vähenemise. sätted Suhteline ajaaken Analüüsiti 25–50 ROI-d parvede ja täppide jaoks ning 15-25 ROI-d kukkumiste jaoks, kujutised valiti enam kui 4 korduse hulgast, mis salvestati vähemalt 3 sõltumatust katsest.Kahepoolseid t-teste on kasutatud liikide või koatservatsioonisüsteemide statistiliste erinevuste hindamiseks.Eluea (τ) pikslite kaupa analüüsimiseks arvutati iga kanali kogu kasutusaja sumbumine väljal ja viidi läbi 2/3-komponendilise eksponentsiaalse sumbumise mudeli ligikaudne väärtus.Seejärel kohandati iga piksli eluea sumbumine eelnevalt arvutatud τ väärtuste abil, mille tulemuseks oli pseudovärviline FLIM-i sobiv pilt.Saba sobiv eluiga oli sama kanali kõigi piltide puhul sama ja iga lagunemine tekitas piisavalt footoneid, et tagada usaldusväärne sobivus.FRET-analüüsi jaoks valiti pikslid, rakendades madalamat intensiivsusläve 100 footoni, mis keskmistas taustasignaali (FBG) 11 footoni.Iga kanali fluorestsentsi intensiivsust korrigeeriti eksperimentaalselt määratud parandusteguritega: 69 spektraalse läbirääkimise α oli 0,004, otsese ergastuse β oli 0,0305, tuvastamise efektiivsus γ oli 0,517.Seejärel arvutatakse FRET-i efektiivsus pikslite tasemel järgmise võrrandi abil:
kus FDD on doonorikanalis (roheline) täheldatud fluorestsentsi intensiivsus, FDA on aktseptori (punases) kanalis kaudse ergastuse korral täheldatud fluorestsentsi intensiivsus ja FAA on aktseptori (punases) kanalis otsese ergastuse korral täheldatud fluorestsentsi intensiivsus ( PIE).Kanalis täheldatakse fluorestsentsi intensiivsuse impulsse).
Asetage 100 µl LLPS reaktsioonilahuseid, mis sisaldavad 25 µM märgistamata monomeerset Tau441 (koos 25 µM αS-ga või ilma) LLPS puhvris (täiendatud nagu ülal) mittesiduvatele 96 süvendiga mikroplaatidele, mis on kaetud kleepuva fooliumkattega ja tilkade moodustumist kontrolliti pärast WF mikrokoopiat. tasakaalustamine.10 min jooksul.Pärast 48-tunnist inkubeerimist toatemperatuuril kinnitati valguparvede ja laikude olemasolu.Seejärel eemaldage vedelik ettevaatlikult süvenditest üle parve, seejärel lisage 50 l dissotsiatsioonipuhvrit (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ja inkubeerige 10 minutit.Kõrge soolakontsentratsioon tagab, et LLPS ei kordu jääk-PEG tõttu ja võimalikud valgukoostised, mis moodustuvad ainult elektrostaatiliste interaktsioonide tõttu, võetakse lahti.Seejärel kaabiti kaevu põhi ettevaatlikult mikropipeti otsaga maha ja saadud lahus kanti tühja vaatlusauku.Pärast proovide 1-tunnist inkubeerimist 50 µM ThT-ga kontrolliti isoleeritud laikude olemasolu WF mikroskoopia abil.Valmistage ette ultraheliga töödeldud αS fibrillid, inkubeerides orbitaalloksutil 7 päeva 300 µl 70 µM αS lahust PBS-is, mille pH on 7,4, naatriumasiidi 0,01% temperatuuril 37 °C ja 200 p/min.Seejärel tsentrifuugiti lahust kiirusel 9600 x g 30 minutit, pellet resuspendeeriti PBS-is pH 7,4 ja töödeldi ultraheliga (1 min, 50% tsükkel, 80% amplituud Vibra-Cell VC130 sonikaatoris, Sonics, Newton, USA) fibrilliproove. väikeste fibrillide suhteliselt ühtlase suurusjaotusega.
FCS / FCCS analüüs ja kahe värvi kokkulangevuse tuvastamine (TCCD) viidi läbi sama ajalahutusega MT200 fluorestsentskonfokaalse mikroskoobiga (Pico-Quant, Berliin, Saksamaa), mida kasutati FLIM-FRET mikroskoopiakatsetes, kasutades PIE režiimi.Nende katsete jaoks lisati laseri võimsus 6,0 µW (481 nm) ja 6,2 µW (637 nm).Nende laserivõimsuste kombinatsioon valiti selleks, et tekitada kasutatud fluorofooripaaride jaoks sarnane heledus, saavutades samal ajal optimaalsed loenduskiirused ning vältides fotopleegitamist ja küllastumist.Nii andmete kogumine kui analüüs viidi läbi, kasutades kaubanduslikult saadavat SymphoTime64 versiooni 2.3 tarkvara (PicoQuant, Berliin, Saksamaa).
LLPS-i abil saadud isoleeritud αS/Tau agregaatide proovid lahjendatakse isolatsioonipuhvris sobiva monomolekulaarse kontsentratsioonini (tavaliselt 1:500 lahjenduseni, kuna agregaadid on koatservaadiproovidest eraldatuna juba madalal kontsentratsioonil).Proovid kanti otse katteklaasidele (Corning, USA), mis olid eelnevalt kaetud BSA lahusega kontsentratsioonis 1 mg/ml.
PIE-smFRET analüüsi jaoks rohelistes ja punastes kanalites rakendati madalamat intensiivsuse läve 25 footonit, et filtreerida välja monomeersed sündmuste põhjustatud madala intensiivsusega signaalid (pange tähele, et monomeeride arv ületab agregeeritud proove võrreldes isoleeritud agregaatidega).See lävi arvutati puhta monomeeri proovide analüüsimisel saadud monomeerse αS viiekordse keskmise intensiivsusena, et analüüsiks konkreetselt valida agregaadid.PIE-ajami vooluahel koos TSCPC andmete hankimisega on võimaldanud rakendada eluaegset kaalumisfiltrit, mis aitab kõrvaldada tausta ja spektraalse ülekõla.Ülaltoodud lävede abil valitud valgustugevust korrigeeriti, kasutades keskmist taustsignaali, mis määrati ainult puhvrit sisaldavate proovide esinemise histogrammide ja intensiivsuse/salve alusel.Suurte agregaatidega seotud katkestused hõivavad tavaliselt ajajäljes mitu järjestikust salve (määratud 1 ms).Nendel juhtudel valiti maksimaalse tugevusega prügikast.FRET ja stöhhiomeetrilise analüüsi jaoks kasutati teoreetiliselt määratud gammategurit γ (0,517).Spektraalne läbirääkimine ja otsene ergastus on kasutatava ergastava laseri võimsuse juures tühised (määratud katseliselt).FRETi efektiivsus ja stöhhiomeetria plahvatuse korral arvutatakse järgmiselt.