347 roostevabast terasest spiraaltoru keemiline komponent, uudsete interferoonile reageerivate inimese leukotsüütide antigeen-A (HLA-A) chaperoonvalkude tuvastamine ristseotud massispektromeetria (CLMS) abil

Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Kasutate piiratud CSS-i toega brauseri versiooni.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Lisaks näitame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiilide ja JavaScriptita.
Liugurid, mis näitavad kolme artiklit slaidi kohta.Kasutage slaidide vahel liikumiseks nuppu Tagasi ja Järgmine või igal slaidil liikumiseks lõpus olevaid slaidijuhtnuppe.

Tootekirjeldus

Roostevabast terasest 347L torud, terase klass: SS347L

Interferooni signaalisüsteem indutseerib tugeva tsütokiini vastuse paljudele patogeensetele ja sisemistele patoloogilistele keskkonnast tulevatele signaalidele, mille tulemuseks on interferooniga indutseeritavate valkude alarühmade indutseerimine.Rakendasime DSS-vahendatud ristsideme massispektromeetriat (CLMS), et tuvastada interferooni poolt indutseeritud valkude domeenis uusi valgu-valgu interaktsioone.Lisaks eeldatavatele interferooniga indutseeritavatele valkudele tuvastasime ka kanooniliste interferooniga indutseeritavate valkude, nagu MX1, USP18, OAS3 ja STAT1, uued molekulidevahelised ja intramolekulaarsed ristseotud aduktid.Keskendusime HLA-A valkude (H2BFS-HLA-A-HMGA1) moodustatud uudse interferooniga indutseeritavate valguvõrkude ortogonaalsele valideerimisele, kasutades kaasimmunosadestamist, ja nende edasisele uuringule molekulaarse dünaamika modelleerimise abil.Valgukompleksi konformatsioonilise dünaamika modelleerimine näitas mitmeid interaktsioonikohti, mis peegeldasid CLMS-i leidudes tuvastatud interaktsioone.Koos tutvustame CLMS-i pilootuuringut, et tuvastada interferooni poolt indutseeritud uued signaalikompleksid, ja ootame CLMS-i laiemat kasutamist, et tuvastada valkude interaktsioonide uus dünaamika kasvaja mikrokeskkonnas.
Enne adaptiivse immuunvastuse algust loob peremeesorganismi kaasasündinud kaitsesüsteem antimikroobse vastuse, mida vahendab sekreteeritud alfa-spiraalsete tsütokiinide perekond, mida nimetatakse interferoonideks (IFN).I tüüpi IFN-klassid IFNa ja IFNβ aktiveerivad rakulisi vastuseid, sealhulgas viirusevastaseid, proapoptootilisi, põletikueelseid ja antiproliferatiivseid seisundeid.Inimestel on teada 13 IFNa alatüüpi, mis kõik on koondunud kromosoomi 91. Üllataval kombel on kliiniliseks kasutamiseks uuritud ainult IFNa2.Viimasel ajal on erilist tähelepanu pööratud IFNα teiste alatüüpide uurimisele.
On kindlaks tehtud, et aktiveeritud I tüüpi interferooni retseptori kompleksid (IFNAR1 ja IFNAR2) käivitavad signaaliülekande kaskaadi, mida vahendavad Januse kinaasid TYK2 ja JAK15,6.Need Januse kinaasid fosforüleerivad türosiinijääkidele signaalimuundureid ja transkriptsioonivalgu aktivaatoreid (STAT1 ja STAT2), et algatada SH2 domeeni vahendatud heterodimerisatsioon6.Seejärel seob IRF9 STAT-i heterodimeere, moodustades IFN-stimuleeritud faktori 3 geeni (ISGF3) trimeerse kompleksi, mis translokeerub tuuma ja indutseerib enam kui 2000 interferooniga stimuleeritud geeni (ISG) transkriptsiooni5, 6, 7, 8.
ISG-d moodustavad kaasasündinud immuunsüsteemi selgroo, eriti vastuseks viirusrünnakule.Esimese kaitseliinina viirusnakkuse vastu kasutavad rakud kiiresti laiaulatuslikke rakuvalkude interaktsioone, millel on lai valik bioloogilisi aktiivsusi.Need valgud hõlmavad mustrituvastusretseptoreid, signaalmolekule, transkriptsioonifaktoreid ja valke, millel on otsene viirusevastane toime, aga ka immuunvastuste negatiivsed regulaatorid9.Kuigi need uuringud on kindlaks määranud üksikute ISG-de viirusevastased omadused, jäävad iga ISG aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid suures osas teadmata.Teaduslik tugi 15 , 16 .
Põhiline bioloogiline protsess, mis on seotud nakkuse ja pahaloomulise transformatsiooni pärssimisega, on antigeeni esitlus, mida vahendavad peamised histocompatibility complex (MHC) molekulid.Lõhustatud, enneaegselt lõppenud või valesti volditud valkude peptiidid (8–12 aminohapet pikad) laaditakse MHC-I heterodimeeri (koosneb MHC-I rasketest ja kergetest ahelatest, mida nimetatakse β-2-mikroglobuliiniks; β2M)17,18.Saadud stabiilsed MHC-I trimeerid transporditakse raku pinnale, kus nad esitlevad rakusiseseid peptiide CD8+ T-rakkudele (tsütotoksilised T-rakud)17.T-rakud tunnevad ära ja hävitavad need patogeenid ja kasvajaspetsiifilist antigeeni kandvad rakud.Järelikult pärsivad patogeenid ja kasvajarakud sageli antigeeni esitlusprotsessi, et vältida immuunseiret.Lisaks on MHC-I alareguleeritud 40–90% inimese kasvajatest ja seda seostatakse sageli kehvema prognoosiga19.
Patogeenidele reageerimisega seotud geenid peavad kiiresti lülituma puhkeoleku ja aktiivse transkriptsiooni oleku vahel.Seetõttu eeldatakse, et mitmed rakuvalgud osalevad vastuses suurele IFN-i nõudlusele lühikese aja jooksul, sealhulgas promootorkromatiini 20, 21 ümberkujundamine ja modifitseerimine.Enamik uuringuid on keskendunud üksikute ISG valgupartnerite tuvastamisele IFN juuresolekul.Mitmed proteoomilised ja transkriptoomilised uuringud mudelrakusüsteemides on selgitanud IFN-i mõju rakumaastikule.Vaatamata kasvavale arusaamisele interferoonide indutseeritud dünaamikast, teame siiski vähe ISG-de kaasamisest.Arvestades interferooni signaalimise keerukust ja ajast sõltuvat dünaamikat, tekib kaks küsimust: (i) kas on võimalik stabiliseerida ja kinni püüda kiires signaalimises osalevaid multivalgu komplekse ning (ii) kas neid interaktsioone saab kaardistada 3D-ruumi?
Nende probleemide lahendamiseks rakendasime disuktsiinimiidi suberaadi vahendatud keemilise ristsidumise (DSS) koos massispektromeetriaga (CLMS), et uurida IFNα-indutseeritud valkude interaktsioonivõrku ja selle dünaamikat.DSS lisab kovalentseid sidemeid valkude proksimaalsete jääkide ja/või valgukomplekside vahele in vivo.Järgnev MS analüüs paljastab spetsiifilised ristsidumissaidid, mis peegeldavad teatud valgu piirkondade ruumilist lähedust, mida nimetatakse sisesidemeteks või valgukomplekside subühikuteks, mida nimetatakse vastastikusteks suheteks.Seda lähenemisviisi kasutades oleme tuvastanud mitu uudset valgu-valgu kompleksi ning interferooni poolt indutseeritud multivalgu interaktsioonivõrgustikke.Nende uute interaktsioonide alamhulka täiendavalt testides demonstreerime, et H2BFS (H2B histooni tüüpi FS; edaspidi H2B) ja MDN1 toimivad HLA-A sidumispartneritena.
Flo-1 rakud on söögitoru adenokartsinoomi üks tuntumaid in vitro mudeleid, kuna need jäljendavad söögitoru kasvajate põhijooni 22, 23.Leiti, et ISG-d (MX1, IFITM1, OAS1/2 ja ISG15) indutseeriti tugevalt 6 tunni pärast, jäljendades klassikalisi keskmise ja hilise faasi vastuseid IFNa-le (joonis 1A).Need andmed näitavad koos, et seda rakumudelit saab kasutada interferooni vastuste uurimiseks.
Diferentsiaalsed valgu ekspressioonivastused Flo-1 rakkudes pärast IFNa-ravi.(B) Coomassie sinisega värvitud tervete rakuekstraktide SDS-PAGE geelid pärast ristsidumist DSS-iga näidatud aegadel ja kontsentratsioonidel.(C) Tüüpiline immunoblot, mida uuriti samade proovide p53(DO-1) antikehaga, et hinnata valkude ristsidumise astet.
To determine the optimal DSS concentration and avoid over-crosslinking, we first exposed the cells to 5, 2.5, and 1 mM DSS for 5, 10, 5, and 30 minutes, respectively, and analyzed the lysates by Coomassie-stained SDS-PAGE (andmeid pole näidatud) .Rakulüsaadid näivad olevat madalaima kontsentratsiooni ja lühima ajahetke juures tugevalt ristseotud.Seetõttu tiitriti DSS 5 minuti jooksul väärtuseni 1, 0,5 ja 0,1 mM (joonis 1B).Optimaalset ristsidumist täheldati 0, 5 mM DSS-iga 5 minuti jooksul ja need tingimused valiti IFNa-ga töödeldud rakkude jaoks.Lisaks on joonisel fig 1C näidatud Western blot, mis viidi läbi p53 (DO-1) antikehaga, et hinnata valgu ristsidumise määra.
Flo-1 rakke töödeldi 24 tundi enne ristsildaja lisamist 10 ng/ml IFNa-ga.Ristseotud rakud lüüsiti seejärel kaheetapilise proteolüüsiga ja valke töödeldi FASP-ga (joonis 2)24,25.Ristseotud trüptilisi peptiide analüüsiti massispektromeetria abil (joonis 2).Seejärel sobitatakse MS/MS spektrid valgujärjestusega ja kvantifitseeritakse MaxQuant26,27 abil.Lisaks järjestab see iga ristviite ID-skoorina vastavalt MS/MS29 spektrikvaliteedile.Tuvastatud on mitmeid väga usaldusväärseid valk-valk interaktsioone ja komplekse ning täiendavalt on uuritud uut interaktsioonide komplekti, kasutades komplekside kaasimmunosadest ja konformatsioonilisi muutusi, kasutades molekulaardünaamika (MD) modelleerimist (joonis 2) 30, 31.
CLMS-meetodi skemaatiline ülevaade.Flo-1 rakke töödeldi 10 ng/ml IFNa-ga 24 tundi, millele järgnes in situ valgu ristsidumine, kasutades DSS-i, millele järgnes rakkude lüüs ja trüpsiniseerimine.Ristseotud proove analüüsiti massispektromeetriga Orbitrap ja LC-MS/MS ajal võeti täiendavalt proove peptiidi prekursorite fragmenteerumise suhtes.Saadud spektritest tuvastati kaks aheldatud peptiidi, kasutades programmi Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL) ja kõik ühendid ühendati arvutuslike torustike abil keerukaks võrguks.Filtreerige valepositiivse määra (FDR) skooride põhjal madala usaldusväärsusega interaktsioonid.Kaasimmunosadestamise abil kinnitati täiendavalt mitmeid uusi ülitäpsusega valgu-valgu interaktsioone ja komplekside konformatsioonilisi muutusi uuriti molekulaarse dünaamika (MD) modelleerimise abil.
Stimuleerimata ja stimuleeritud IFNa proovides tuvastati MaxQuanti abil vastavalt ~ 30 500 ja ~ 28 500 peptiidi (täiendav tabel S1, joonis 3A).Lisaks oli IFNα-ga töödeldud proovides suurem osa suurematest peptiididest vahemikus 40–55 (joonis 3C).Valgu kaardistamine log2 intensiivsuse suhtes näitas, et klassikalisi interferooniga stimuleeritud valke oli kõige rohkem võrreldes töötlemata proovidega, sealhulgas MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 ja HLA-F (joonis 3D).IFNa-ravi vastusena enam kui kolm korda rikastatud valkude radade analüüs, kasutades Reactome raja andmebaasi, näitas, et MHC-I-vahendatud antigeeni esitus ja töötlemine oli kõige domineerivam rada (joonis 3E).Kooskõlas varasemate aruannetega olid aktiveeritud radade hulgas OAS ja ISG15 vahendatud viirusevastased vastused, samuti IFNα / β ja tsütokiinide signaalimine.Lisaks tuvastati SIM-XL abil algselt omandatud MS/MS spektritest lüsiini- ja seriinispetsiifilised valgu ristsidemed.Hiljutises uuringus teatati 104 ISG-st, mis hõlmasid 20 viirust 9 viiruseklassist 5 rakutüübi üksikute ISG üleekspressiooniuuringute metaanalüüsi põhjal9.Suurte andmekogumite skriinimise arvutuslike piirangute ületamiseks alustasime siiski väiksema andmekogumiga, et uurida võimalikke koostoimeid Padaria jt esitatud IRDS-geenide loendi vahel, millest enamik on ISG-d.
Erinevalt ekspresseeritud ristseotud valkude identifitseerimine vastuseks IFNa-le (andmed saadi MaxQuantilt).(A) Venni diagramm, mis kujutab IFNα14-ga töödeldud ja töötlemata Flo-1 proovides tuvastatud tavaliste ja eksklusiivsete peptiidide arvu.Töötlemata (B) ja IFNa-ga töödeldud (C) ristseotud proovide peptiidi pikkuse jaotus.(D) Soojuskaart, mis näitab log2 (LFQ intensiivsus) töötlemata ja IFNa14-ga töödeldud Flo-1 rakkude vahel.Vasakpoolne paneel näitab valke, mis on IFNa juuresolekul kõige aktiivsemalt aktiveeritud.(E) Histogramm, mis esindab 20 peamist rikastamise rada pärast IFNa-ravi.Reactome raja andmebaas analüüsis enam kui neljakordseid muutusi ülesreguleeritud IFNα-le reageerivates valkudes.
Interferooni vahendatud ISG stimulatsioon on hästi dokumenteeritud, kuid molekulaarsel tasemel on halvasti mõistetav, kuidas need valgud kulmineeruvad paljude bioloogiliste funktsioonidega.Uurisime valkude interaktsioone tuntud ISG-de vahel suure usaldusväärsusega.Huvitaval kombel tuvastasime võrgu, mis sisaldab MX1, USP18, ROBO1, OAS3 ja STAT1 valke, mis moodustavad vastusena IFNa-ravile suure kompleksi (joonis 4, tabel S2) 32, 33, 34.Kõige tähtsam on see, et need koostoimed leiti kõigis kolmes IFNa-ga töödeldud eksemplaris ja neid ei leitud töötlemata proovides, mis viitab sellele, et need tekkisid spetsiifiliselt vastusena IFNa-ravile.On teada, et STAT1 reguleerib nende ISG-de ekspressiooni transkriptsiooniliselt, kuid selle koostoimet ISG-dega valgu tasemel ei ole uuritud.STAT1 kristallstruktuur näitas, et selle spiraalne domeen (CCD) ei osale interaktsioonis DNA või protomeeridega dimeeride moodustumise ajal35.Need α-heeliksid moodustavad spiraalse spiraalse struktuuri, mis annab interaktsioonide toimumiseks valdavalt hüdrofiilse pinna35.Meie CLMS-i andmetes täheldasime, et enamik interaktsioone STAT1-ga toimus CCD-le eelnevas SH2 domeenis, linkerdomeenis või C-terminaalses sabas (jäägid 700–708) (joonis 4A).Eelmises uuringus teatati, et USP18 seondub STAT2 CCD ja DNA-siduva domeeniga (DBD) ning värvatakse I tüüpi interferooni retseptori IFNAR2 alaühikusse, et vahendada I tüüpi interferooni signaaliülekande pärssimist24.Meie andmed näitasid ka, et USP18 katalüütiline domeen interakteerub STAT1 DBD-ga (joonis 4A, D), mis viitab sellele, et nii STAT1 kui ka STAT2 võivad mängida rolli USP18 meelitamisel IFNAR2-sse.
Valk-valgu ISG-võrk, mis tuvastati IFNa-ga töödeldud ristseotud rakkudes.(A) 2D interaktsiooni graafik, mis näitab valkude ja valkude interaktsioone (loodud programmis SIM-XL) koos joontega, mis tähistavad molekulidevahelisi interaktsioone (ristlingi piirväärtus on seatud väärtusele 3,5).Erineva identiteediga domeenid on tähistatud värviga32: MX1 domeen, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) ja GED (569–660).OAS3 domeenid: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) ja OAS1_C (903-108).Domeen ROBO1, Ig_3 (67–151), I-komplekt (170–258), I-komplekt (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ja fn3 (777–864).STAT1 väljad: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) ja STAT1_TAZ2bind (715–739).Ristsidemete künniseks määrati 3,5.Joonisel on ristlingi skoori lävi seatud väärtusele 3,0.(G) mitmesugused interaktsioonisaidid STAT1 ja OAS3 DI domeenide vahel, mis on nende valgustruktuuride peal PyMol (PyMOL molekulaargraafika süsteem, versioon 2.0 Schrödinger, LLC.);) programm.
Inimestel on kirjeldatud kahte USP18 isovormi, täispikka valku, mis paikneb valdavalt tuumas, ja N-terminaalse domeenita isovorm USP18-sf, mis on tsütoplasmas ja tuumas ühtlaselt jaotunud36.Lisaks ennustati, et N-ots on struktureerimata ega vaja isopeptidaasi aktiivsust ega ISG1537 seondumist.Enamik meie uuringus tuvastatud interaktsioone asus valgu N-otsas, mis viitab sellele, et need interaktsioonid hõlmavad täispikka USP18 (joonis 4A, D) ja esinevad seega tõenäoliselt tuumas.Veelgi enam, meie andmed näitavad ka seda, et N-ots on spetsialiseerunud valkude ja valgu interaktsioonidele.IFNAR2 sidumissait paikneb jääkide 312-368 vahel ja ükski kompleksi valk ei seondu selle piirkonnaga (joonis 4A)37,38.Need andmed kokku võttes näitavad, et IFNAR2 siduvat domeeni kasutab ainult retseptorvalk.Lisaks leiti, et ainult OAS3 ja ROBO1 on seotud N-otsast ja IFNAR2 sidumissaidist ülesvoolu asuvate domeenidega (joonis 4A).
Aminohapetest ~1100 kuni 1600 ulatuv piirkond on enamasti korrastamata.Leidsime, et MX1 interakteerub ROBO1-ga Ig, Fn ja intratsellulaarsete domeenide kaudu, samas kui enamik interaktsioone STAT1-ga toimub selle CCD, linkerdomeeni ja ROBO1 C-otsa vahel (joonis 4A, E).Teisest küljest olid interaktsioonid DI, DIII ja OAS3 linkeri piirkondadega jaotunud kogu ROBO1 valgu ulatuses (joonis 4A).
Oligoadenülaadi süntaasi (OAS) valgu perekond aktsepteerib ja seob rakusisest kaheahelalist RNA-d (dsRNA), läbib konformatsioonilisi muutusi ja sünteesib 2',5'-seotud oligoadenülaate (2-5 As) 40 .Leiti, et kolmest OAS-st on OAS3-l kõrgeim afiinsus dsRNA suhtes ja see sünteesib kõige vähem 2-5 As-d, mis võivad aktiveerida RNaasi L ja seeläbi piirata viiruse replikatsiooni41.OAS perekond koosneb polümeraasi beeta (pol-β) sarnastest nukleotiidi transferaasi domeenidest.Varasemad uuringud on näidanud, et C-terminaalse domeeni (DIII) katalüütiline aktiivsus sõltub dsRNA-d siduvast domeenist (DI), mis on vajalik OAS342 aktiveerimiseks.Me täheldasime, et OAS3 DI ja DII domeenid interakteeruvad CCD-ga ja väikese ristmikupiirkonnaga SH2 ja STAT1 TAD vahel (joonis 4A, F).Valgu struktuuri erinevate ristsiduvate saitide katmine näitas β-lehe ja DBD STAT1 silmuse vastastikmõju ning OAS3 DI domeeni jääkidest 60–75 moodustatud avatud tasku või õõnsust (joonis 4G).Orientatsioon valkude kompleksi näitas ka, et ükski interaktsioonid OAS3 häirinud DNA-siduva võime oma DI domeeni (joonis S1).Lisaks interakteerub GTPaasi MX1 N-terminaalne domeen ulatuslikult OAS3 DI ja DIII domeenidega (joonis 4A).
MX proteins are part of a large family of dynein-like GTPases that contain an N-terminal GTPase domain that binds and hydrolyzes GTP, an intermediate domain that mediates self-assembly, and a C-terminal leucine zipper that acts as a GTPase (LZ ).domeeni efektordomeen25,43.MX1 seondub viiruse polümeraaside subühikutega, et blokeerida viiruse geeni transkriptsioon43.Varem teatatud pärmi kahe hübriidsõel näitas, et PIAS1-ga seotud MX1 inhibeerib STAT1-vahendatud geeni aktivatsiooni, blokeerides DNA-ga seondumise aktiivsust, ja sellel on ka SUMO E344,45 ligaasi aktiivsus.Siin demonstreerime, et MX1 seondub STAT1-ga (joonis 4C, D), kuid kuidas see interaktsioon mõjutab STAT1-vahendatud geeni aktiveerimist vastuseks IFNa-le, vajab täiendavat uurimist.
DDX60 on IFN-indutseeritud tsütoplasmaatiline helikaas, millel on varem teatatud, et see mängib rolli viiruse RNA46 RIG-I-st sõltumatus lagunemises.See interakteerub RIG-I-ga ja aktiveerib selle signaaliülekande ligandispetsiifilisel viisil 46. DDX60 koosneb DEXD/H-Box helikaasi domeenist ja C-terminaalsest helikaasi domeenist, mis seovad viiruse RNA-d ja DNA-d47.Enamik selle koostoimeid MX1 ja IFIT3 esinevad pikkade N- ja C-terminaalsetes piirkondades ilma kanooniliste domeenide või motiivideta (joonis S2E, F).Kuid MX1 on seotud ka DEXD/H-Box helikaasi domeeniga (joonis S2E).IFIT perekonna valkudel on tandemkoopiad iseloomulikust helix-turn-helix motiivist, mida nimetatakse tetrapeptiidi korduseks (TPR).Leiti, et IFIT3 on RIG-I signaalimise positiivne modulaator ja seega MAVS-kompleksi komponent.
Arvestades, et kogu proteoomi sõelumine on arvutuslikult intensiivne, sõelusime seejärel kogu inimese UniProti andmebaasi ühe IFNα-ga töödeldud korduse olemasolu suhtes.Selles koopias leidsime HLA-A jaoks mitu väga usaldusväärset suhtlusvõrgustikku.MS/MS spektri abil tuvastatud valguradade analüüs näitas, et MHC-I-põhine antigeeni töötlemine ja esitus on peamine interferooni poolt indutseeritud rada (joonis 3D).Seetõttu keskendusime MHC-I molekulide valkude interaktsioonide uurimisele suure usaldusväärsusega kõigis ristseotud proovides.HLA koosneb α1, α2 ja α3 domeenidest ja kergetest ahelatest ning mikroglobuliin β2 (β2m) on konstantne chaperone valk49.Kui HLA on endoplasmaatilises retikulumis kokku pandud, on see peptiidligandide puudumisel ebastabiilne50.Peptiidi siduva soone moodustavad väga polümorfsed ja struktureerimata α1 ja α2 domeenid mittepeptiidi kujul ning suhteliselt vähem polümorfne α351 domeen.IFNα juuresolekul tuvastasime kaks HLA-A kompleksi: üks interakteerub HMGA1 ja H2B-ga (joonis 5, tabel S3) ja teine ​​interakteerub MDN1, LRCH4 ja H2B-ga (joonis 6).
IFNa indutseerib HLA-A interaktsioonivõrgustiku H2B (H2BFS) ja HMGA1-ga.(A) 2D graafik (genereeritud SIM-XL tarkvaras), mis kujutab erinevat tüüpi interaktsioone H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksis: omavahelised sidemed (sinine), omavahelised sidemed (punane) ja üksik link (must)..Erineva identiteediga domeenid on värvikoodiga32: H2B (histoon; 2–102) ja MHC-I (MHC_1; 25–203, rühm C1; 210–290 ja MHC_I_C; 337–364).Ristsidemete künniseks määrati 3,5.Punktgraafikud näitavad HLA-A interaktsiooni saite H2B (B) ja HMGA1 (C) ning K või S interaktsiooni saite kahe peptiidi vahel.Joonisel on ristlingi skoori lävi seatud väärtusele 3,0.(D) PyMOL-programmis H2B, HLA-A ja HMGA1 valkude struktuurides näidatud valkude vahelised seosed.Need struktuurid modelleeriti Phyre2 serveriga (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ja H2B, HLA-A ja HMGA1 valkude mallistruktuurid olid vastavalt 1kx552, 1kj349 ja 2eze55.
IFNa indutseerib HLA-A interaktsioonivõrgu H2B (H2BFS), MDN1 ja LRCH4-ga.(A) Intramolekulaarsed (punased) ja molekulidevahelised (sinised) ristsidemed, mis on esitatud 2D interaktiivsel kaardil (genereeritud SIM-XL tarkvaras), kus MDN1 on kujutatud ringina.Ristsidemete künniseks määrati 3,5.Erineva identiteediga domeenid on värvikoodiga32: H2B (histoon; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, rühm C1; 210–290 ja MHC_I_C; 337–364) ja LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) ja CH (535–641)).(B) PyMOL-programmis H2B, HLA-A, LRCH4 ja MDN1 valkude struktuurides näidatud valkude vahelised seosed.Need struktuurid modelleeriti Phyre2 serveriga (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) mallistruktuuridega 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ja 6i2665 valkude H2B, HLA-A, LRCH4 ja MDN1 jaoks, vastavalt.Punktgraafikud, mis näitavad K või S interaktsioonisaite HLA-A ja H2B (C), LRCH4 (D) ja MDN1 (E) jaoks.Jooniste puhul määrati ristsidemete skoori läviväärtuseks 3,0.
Lisaks genoomi terviklikkuse säilitamisele osaleb histoon H2B ka transkriptsiooni reguleerimises.H2B valk koosneb tsentraalsest histooni domeenist (HFD), mis on moodustatud kolmest α-heeliksist, mis on eraldatud silmustega, ja C-terminaalsest sabast 41, 52.Suurem osa koostoimest H2B-ga toimub α1 heeliksis, mis tagab trimerisatsiooni HFD heterodimeeriga (joonis 5A, B).Kuigi lüsiinid osalevad DNA sidumises, on mõned lüsiinid ka alternatiivsed atsetüülimis- või metüülimiskohad.Näiteks H2B jäägid K43, K46 ja K57 ei osale otseses DNA sidumises, vaid on erinevate transkriptsioonijärgsete modifikatsioonide sihtmärgid53.Sarnaselt võivad H2B jäägid K44, K47 ja K57 mängida alternatiivset rolli IFNa juuresolekul, sealhulgas interaktsioonides teiste valkudega (joonis 5A, B).Lisaks aktiveerib ekstrakromosomaalne histoon H2B immuunvastust erinevates rakutüüpides, toimides tsütosoolsensorina, et tuvastada kaheahelalise DNA (dsDNA) fragmente, mis on saadud nakkusetekitajatest või kahjustatud rakkudest54.Samuti on teada, et H2B liigub tuumast sisse ja välja kiiremini kui teised tuuma histoonid54.Valitud töötlemata proovides täheldati ka H2B interaktsioone MDN1 ja LRCH4-ga.Leidsime, et HLA-A interakteerub H2B-ga kõigis kolmes IFNa-ga töödeldud proovis ja ühes töötlemata kordusproovis.Need andmed peegeldavad H2B rolli alternatiivses füsioloogilises funktsioonis, mis ei sõltu transkriptsiooni regulatsioonist.
HMGA1 (kõrge liikuvusega rühm AT-Hook 1), väike nukleoproteiin, mis on rikas haigust soodustavate aminohapete poolest, on tuvastatud koos HLA-A-ga.Sellel on happeline C-terminaalne saba ja kolm erinevat DBD-d, mida nimetatakse AT-konksudeks, kuna need seonduvad dsDNA55,56 AT-rikka piirkonna väiksema soonega.See seondumine põhjustab DNA paindumise või sirgumise, võimaldades kanoonilistel transkriptsioonifaktoritel pääseda juurde selle konsensusjärjestusele.Arvatakse, et C-terminaalne saba on seotud valgu-valgu interaktsioonidega ja transkriptsioonifaktorite värbamisega, kuna C-otsa deletsioonimutandid ei suuda transkriptsiooni algatada57.Lisaks sisaldab see domeen mitmeid konserveerunud fosforüülimissaite, mis on kinaaside tuntud substraadid58.Me täheldasime HLA-A ja H2B interaktsioone HMGA1-ga väljaspool C-terminaalset domeeni, mis viitab sellele, et C-terminaalset domeeni kasutatakse peamiselt transkriptsioonifaktori sidumiseks (joonis 5A, C).HMGA valgud konkureerivad histooni H1-ga seondumisel adapter-DNA-ga, suurendades seeläbi ligipääsetavust57.Samamoodi tundub tõenäoline, et HMGA interakteerub histooniga H2B piki linkeri DNA-d, konkureerides histooniga H1.HMGB1 indutseerib HLA-A, -B ja -C ekspressiooni dendriitrakkudes, mis viib nende aktiveerumiseni59, kuid HMG ja HLA vahelist koostoimet ei ole varem teatatud.Leidsime, et HMGA1 interakteerub HLA-A α1 ja α3 domeenidega, kusjuures enamik interaktsioone on väljaspool selle 3 DBD-d (joonis 5A, C).Meie käes leiti, et HLA-A paikneb tuumas (andmeid pole näidatud) ja arvestades, et tuumas on ka H2B ja HMGA1, toimub see interaktsioon tõenäoliselt tuumas.H2B, HLA-A ja HMGA1 vahel mõõdetud spetsiifilised aduktid on näidatud joonisel 5D.
Enamik HLA-A interaktsioone teiste valkudega toimub selle α1 ja α2 domeenides ning korrastamata C-terminaalses domeenis (joonis 6).Ühes nendest näidetest leidsime, et HLA-A interakteerub LRCH4 korrastamata N-terminaalse sabaga (joonis 6A, D).LRCH4 reguleerib TLR4 aktiveerimist ja LPS tsütokiinide induktsiooni, moduleerides seeläbi kaasasündinud immuunvastust 60, 61.On teatatud, et CH domeenid vahendavad valk-valk interaktsioone 60 .Umbes 300 aminohappest koosnev lõik LRR ja CH domeenide vahel on suhteliselt ligipääsetav, kuid korrastamata.Tuginedes korrastamata piirkondade funktsioonile valk-valgu võrgustike ja vesikulaarse transpordi vahendajatena 63, leidsime, et enamik valkude interaktsioone esineb korrastamata piirkondades.Koostoimed MDN1-ga jaotati kogu valgu pikkuses, kaasa arvatud LRR1, LRR6, CH domeenid ja juhuslikud piirkonnad, samas kui H2B seostus peamiselt CH domeeniga (joonis 6A, B).Nimelt ei hõlmanud ükski interaktsioon TMJ-d, mis viitab CLMS-i lähenemisviisi spetsiifilisusele (joonis 6A, B).
MDN1 on tuvastatud ka HLA-A valguvõrgu osana (joonis 6A).See kuulub AAA valkude perekonda (erinevate tegevustega seotud ATPaasid).See on sama N-terminaalne AAA domeen, mis organiseerub heksameerseks ringiks ja eemaldab 60S 64 ribosomaalsest subühikust koosnemisteguri.näib olevat sarnane dynein64, 65, 66-ga.Lisaks järgneb Asp/Glu-rikkale piirkonnale MIDAS domeen (metalliioonist sõltuv sait).MDN1 suure suuruse (ligikaudu 5600 aminohapet) ja selle piiratud homoloogia tõttu hästi uuritud valkudega on selle struktuuri ja funktsiooni kohta inimestel vähe teada.Tuvastasime HLA-A, H2B ja LRCH4 kui MDN1 sidumispartnerid ja näitasime nende orientatsiooni valgukompleksidena PyMolis (joonis 6A, B).Need kolm valku interakteeruvad AAA domeeniga, düneiinitaolise linkerdomeeniga ja võib-olla ka MIDAS MDN1 domeeniga.Eelmises aruandes tuvastas söödavalkude afiinsuspuhastus MDN1 kui valku, mis on seotud histooni H2B67-ga.Selle kompleksi tuvastamine IFNa-ga töödeldud proovides viitab MDN1 rollile interferooni signaaliülekandes.
Kuna HLA geenid on väga polümorfsed, eraldasime Flo-1 rakkude RNA sekveneerimisandmetest HLA-A, -B ja -C kaardistavad sekveneerimislugemid (andmeid pole näidatud).Peptiidijärjestused, mis olid kooskõlas sekveneerimise lugemisega, näitasid olulisi erinevusi HLA-A, -B ja -C vahel piirkondades, kus HLA-A-s paiknesid ristseotud peptiidid (joonis S3).Lisaks ei täheldanud me HLA-B/C molekulide valkude ja valkude ristsidumist H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 valkudega.See viitab sellele, et HLA-A, MDN1, LRCH1 ja HMGA1 vahel leitud valgu interaktsioon on HLA-A-spetsiifiline.HLA-A jaoks tuvastatud peptiidid olid kõrge intensiivsusega nii IFNa-ga töödeldud kui ka töötlemata proovides.
Tagamaks, et siin tuvastatud interaktsioonid ei olnud tingitud kahe ruumilises läheduses asuva valgu mittespetsiifilisest ristsidumisest, kinnitasime täiendavalt kahte uut HLA-A interakteeruvat tegurit, tehes kaasimmunosadestamise analüüse.HLA-A interaktsioonid endogeense MDN1 ja H2B-ga tuvastati nii IFNα-ga töödeldud kui ka töötlemata Flo-1 rakkudes (joonis 7, joonis S4).Kinnitasime, et H2B haaras immunosadestesse HLA-A ja et see seos oli tingitud IFNa-ravist, kuna töötlemata rakkude immunosadestamise proovides HLA-A puudus (joonis 7A).Kuid meie andmed viitavad sellele, et IFNa reguleerib erinevalt HLA-A seondumist H2B ja MDN1-ga.IFNa indutseerib seost H2B ja HLA-A vahel, kuid vähendab selle seost MDN1-ga.Leidsime, et MDN1 seostati kontrollides HLA-A-ga ja IFNa lisamine vähendas seda interaktsiooni sõltumata MDN1 induktsioonist IFNa poolt (joonis 7B, C).Lisaks haaras HLA-A immunosadestamine H2B A549 rakkudes (joonis S4), mis viitab sellele, et see interaktsioon on rakutüübist sõltumatu.Kokkuvõttes toetavad need tulemused HLA-A interferooni vahendatud koostoimeid H2B ja MDN1-ga.
HLA-A puhastab koos H2B ja MDN1.Tüüpilised endogeensed H2B (A) ja MDN1 (B) immunoblotid immunosadestati IFNa-ga töödeldud Flo-1 rakkudest ja sondeeriti näidatud antikehade suhtes.Negatiivse kontrollina kasutati hiire ja küüliku IgG-d.(C) Erinevate antigeenide suhtelised kogused (sisend) on kujutatud immunoblotidega, mida uuriti näidatud antikehade vastu, laadimiskontrollina kasutati β-aktiini.
Uuriti ühe interferooni poolt indutseeritud väga töökindla ristseotud võrgu H2B-HLA-A-HMGA1 struktuurseid omadusi.CLMS-i andmete põhjal tehtud järeldused viitavad H2B, HLA-A ja HMGA1 valkude erinevate konformatsioonide võimalusele.Seetõttu modelleeriti lahustikeskkonnas järgmised potentsiaalsed kompleksid: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A ja H2B-HLA-A-HMGA1.Esialgne valgu-valgu dokkimissõel, kasutades MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) paketti, näitas võimalikke konformatsioone, mis nende valkude vahel erinevad (joonis 8A).Dokkimisvalgukompleksi visualiseerimine näitas mitmeid koostoimeid ja võimalikke konformatsioone (joonis 5A, 8).Seega on üks võimalik konformatsioon näidatud joonisel 8A (märgistatud ristsidemetega) ja seda hinnati täiendavalt MD modelleerimiskonveieri abil.Lisaks toob H2B või HMGA1 seondumine HLA-A-ga esile H2B kõrgema afiinsuse HLA-A suhtes (joonis 8A).
Võimalike võrkude konformatsiooniline dünaamika komplekside H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A ja H2B-HLA-A-HMGA1 vahel.(A) Vasak paneel on 2D-kaart (genereeritud SIM-XL-i tarkvaras) molekulisiseste (punane) ja molekulidevaheliste (sinine) ristsidemete kohta (ristlingi piiriks on seatud 3,5).Lisaks märgitakse tuvastatud ristsiduvad jäägid H2B, HLA-A ja HMGA1 valkude struktuuridele.Nende valkude seotud konformatsioonid ekstraheeriti MOE paketis rakendatud dokkimistorustiku abil.Alumine vasak paneel näitab H2B-HLA-A ja HMGA1-HLA-A komplekside erinevaid võimalikke konformatsioone erineva valgu-valgu sidumisafiinsusega (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Aatomipositsioonide standardhälve (RMSD) (va vesinikuaatomid) iga valgu struktuuri jaoks.(C) Molekulaarsete valkude ja valkude vesiniksidemete interaktsioonid erinevatest simuleeritud kompleksidest, võttes arvesse spetsiifilisi interaktsioone kestusega ≥ 10 ns.H-sideme doonor-aktseptori piirkauguseks määrati 3,5 Å ja doonori-H-aktseptori piirnurga nurgaks määrati ≥ 160–180 °.(D) Märgistatud jäägid, mis moodustavad HLA-A valgu-valgu interaktsioone oma vastavate partneritega, mis hõlmavad ≥ 20 ns, ekstraheeritud näivatest HLA-A-H2B ja HLA-A-HMGA1 kompleksidest.Valgu struktuurid esindavad keskmist struktuuri 100 ns MDS.(E) Interaktsioonid HLA-A-H2B ja HLA-A-HMGA1 komplekside vahel võrreldes interaktsioonidega, mida jälgiti H2B-HLA simulatsiooniga 100 ns jooksul, võttes aluseks kahe peptiidi vahelise K või S interaktsiooni saidi.Kompleksid /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Ristsidemete hindamise läviväärtuseks määrati 3,0 ja arvesse võeti spetsiifilisi interaktsioone MDS-ist, mille kestus oli ≥ 10 ns.Valgustruktuuride visualiseerimiseks kasutati BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) ja Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) pakette.
HLA-A molekulide stabiilsus ajas (standardhälve; RMSD või standardhälve; RMSF) näitas, et H2B või HMGA1 valkude olemasolu kompleksides stabiliseeris HLA-A (joonis 8B, joonis S5).HMGA1 valk seondub tihedalt HLA-A B2M saidiga, indutseerides HLA-A-aminohapete stabiilsust HLA-A-HMGA1 või H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksis (joonis 8B, joonis S5).täpsemalt leiti, et HLA jäägid ~60-90 ja ~180-210 on H2B juuresolekul vähem paindlikud (joonis 8B).H2B ja HMGA1 näitasid paremat seondumist HLA-A-ga H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksis võrreldes HLA-A seondumisega ainult H2B või HMGA1-ga (joonis 8C, D; tabel S5).Vesiniksidemega seotud jäägid (MD-modelleeritud kõrge hõivatus ≥ 10 ns) langevad kokku CLMS-i interaktsioonikohtadega (K- või S-jäägid) kompleksis, mis viitab sellele, et CLMS-i abil tuvastatud interaktsioonid on väga usaldusväärsed.Töökindlus (joonis 8E ).
Valk-valk interaktsioonid moodustavad dünaamilisi struktuurseid võrgustikke, mis vahendavad rakusisest suhtlust vastusena teatud stiimulitele.Rakendasime CLMS-i, et teha kindlaks, kas interferooni poolt indutseeritud valkude paneeli hulgast saab tuvastada uudseid valgu-valgu interaktsioone.Valgukomplekside hõivamiseks kasutati globaalset valkude ristsidumise analüüsi interferoonile reageerivas Flo-1 rakumudelis.Trüptiliste peptiidide ekstraheerimine ristseomata ja ristseotud rakkudest võimaldab peptiidide loendamist, raja rikastamist ja peptiidi pikkuse jaotust määratletud LFQ intensiivsusega.Positiivse sisekontrollina tuvastati kanoonilised interferooniga indutseeritavad valgud, samas kui täheldati kanooniliste interferooniga indutseeritavate valkude, nagu MX1, UP18, OAS3 ja STAT1, uusi molekulidevahelisi ja intramolekulaarseid ristseotud adukte.
Interaktsioon HLA-A, MDN1 ja H2B vahel tuvastati immunoblotimisega IFNa-ga töödeldud ja töötlemata Flo-1 ja A549 rakkudes.Meie tulemused näitavad, et HLA-A komplekseerub H2B-ga IFNa-sõltuval viisil.Meie töö kujutab endast huvitavat võimalust nende kahe kompleksi ühise lokaliseerimise edasiseks uurimiseks.CLMS-i andmete põhjal tehtud järeldused viitavad H2BFS-, HLA-A- ja HMGA1-valkude erinevate konformatsioonide võimalusele.
Flo-1 rakud saadi ATCC-st ja neid hoiti DMEM-is (Gibco), millele oli lisatud 1% penitsilliini/streptomütsiini (Invitrogen), 10% veise loote seerumit (Gibco) ja säilitati 37 °C ja 5% CO2 juures.Inkubeerimine.Enne IFNa14-ga töötlemist (tootja Edinburgh Protein Production Facility) kasvatati rakud 70-80% konfluentsuseni.Kõik muud kemikaalid ja reaktiivid osteti firmalt Sigma Aldrich, kui pole märgitud teisiti.
Flo-1 rakke kultiveeriti 6-süvendilistel plaatidel ja järgmisel päeval töödeldi rakke 10 ng/ml IFNa14-ga 24 tundi kuni ligikaudu 80% konfluentsuse saavutamiseni.Rakke pesti kolm korda PBS-ga ja ligeeriti värskelt valmistatud DSS-iga (Thermo Fisher Scientific) (lahustatud DMSO-s) PBS-is 5 minutit temperatuuril 37 °C lõppkontsentratsioonini 0,5 mM.DSS-i ristsidumise reaktsioon asendati PBS-ga ja DSS-i jääk kustutati 20 mM Tris-i (pH 8,0) lisamisega PBS-is 15 minutiks temperatuuril 37 °C.Rakud koguti kraapides ja koguti madala seondumisvõimega tuubidesse (Axygen).
Rakupelletit lüüsiti 300 µl uurea lüüsipuhvriga (8 M uurea, 0,1 M Tris, pH 8,5) 30 minutit toatemperatuuril, aeg-ajalt loksutades.Kõik tsentrifuugimise etapid viidi läbi 14 000 xg juures 8 °C juures.Ülejäänud selged osakesed lahustati 150 μl teises lüüsipuhvris (2 M uurea, 2% (mass/maht) SDS (naatriumdodetsüülsulfaat)) 30 minutit või kauem, kuni saadi homogeenne vesilahus.Valkude kontsentratsioone hinnati Micro BCA testiga (Thermo Fisher Scientific) vastavalt tootja juhistele mikroplaadi protseduuride kohta.
Ligikaudu 100 μg lahustuvat ristseotud valku töödeldi, kasutades modifitseeritud filtreerimisproovi ettevalmistamise protokolli (FASP), nagu on kirjeldanud Wisniewski et al.69 Lühidalt, valk ristseotakse 200 µl uureapuhvriga (8 M uurea 0,1 M Tris-s, pH 8,5), segatakse vorteksiga ja poolitatakse.Kõik tsentrifuugimise etapid viidi läbi 14 000 xg juures 25 °C juures.Ristseotud valgulüsaadi esimene pool kanti üle 10 kDa Microconi tsentrifugaalfiltriseadmesse, mis oli varustatud Ultracel-10 membraaniga (Merck), millele järgnes tsentrifuugimine filtril 25 minutit.Seejärel lisage valgu teine ​​pool filtrisse ja korrake samu samme.Valgu taastamine viidi läbi, lisades 100 μl 17 mM tris(2-karboksüetüül)fosfiinvesinikkloriidi (TCEP) uureapuhvris.Taastamist segati termomikseris kiirusel 600 p/min 30 minutit temperatuuril 37 °C.Lisaks tsentrifuugiti kolonni ja redutseeritud ristseotud valk alküüliti, kasutades 100 μl 50 mM jodoatsetamiidi uureapuhvris.Alküülimisreaktsioon viidi läbi toatemperatuuril 20 minutit pimedas.Pöörake kolonni, peske kolonni seinu 3 korda 100 µl uureapuhvriga ja seejärel tsentrifuugige.Sama toiming viidi läbi 3 korda, kasutades 100 μl 100 mM ammooniumvesinikkarbonaati.Enne trüpsiniseerimist asendage kogumistoru uuega.Lisage seedimispuhver, mis sisaldab 50 mM ammooniumvesinikkarbonaati ja 1 µl trüpsiini, mis on lahjendatud trüpsiinipuhvris (Promega).Trüpsiini ja valgu suhe hoiti umbes 1:33 juures ja seedimise reaktsioone inkubeeriti üle öö temperatuuril 37 °C niiskes kambris.Ristseotud peptiid elueeriti filtrist tsentrifuugimisega 25 minutit.Peptiidide taastumist parandati, lisades filtrile 50 μl 0,5 M NaCl, millele järgnes tsentrifuugimine 25 minutit.
Ristseotud trüptiliste peptiidide soola eemaldamiseks kasutati C18 Micro Spin kolonne (Harvard Apparatus), järgides Bouchali et al.70 kirjeldatud protokolli väikeste muudatustega.Lühidalt, C18 tsentrifuugimiskolonnid aktiveeriti kolmekordse pesuga 0,1% sipelghappega (FA) atsetonitriilis (AcN) (Merck) ja kahe pesuga 0,1% FA-ga.Kolonni hüdraaditi 0,1% FA-ga 15 minutit.Soolavabad peptiidid elueeriti järjestikku astmelise gradiendiga, kasutades 50%, 80% ja 100% AcN 0,1% FA-s.Elueeritud peptiidid lahustati 100 μl 0,08% trifluoroäädikhappes 2,5% AcN-s ja kontsentratsioonid mõõdeti seadmega NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).
Ristseotud peptiidid eraldati UltiMate 3000 RSLCnano LC süsteemiga (Thermo Scientific), mis oli ühendatud massispektromeetriga Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Ristseotud peptiidid koguti 300 µm ID-ga, 5 mm pikkusega µ-eelse kolonni C18 püüdmiskolonni, mis oli täidetud C18 PepMap100 sorbendi ja 5 µm PepMap sorbendiga (Thermo Scientific).Laadige pumba vooluhulk 5 µl/min 0,08% trifluoroäädikhapet, mis on lahustatud 2,5% AcN-s.Ristseotud peptiidid eraldati analüütilisel sulatatud ränidioksiidi kolonnil siseläbimõõduga 75 μm ja pikkusega 150 mm, mis oli täidetud 2 μm PepMap sorbendiga (Thermo Scientific).Kolonni tasakaalustati 2,5% B juures 8 minutit enne järgmist tsüklit.Analüütilisest kolonnist elueeritud ristseotud peptiidid ioniseeriti nanoelektropihustusionisatsiooni (NSI) allikas ja süstiti Exploris 480 massispektromeetrisse (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 massispektromeeter töötas positiivse andmekorrelatsiooni režiimis.Täielik skaneerimine viidi läbi sektsioonirežiimis eraldusvõimega 120 000 vahemiku seadistustega m/z 350 Th kuni m/z 2000 Th.Normaliseeritud AGC sihtmärk määrati 300% maksimaalse sisestusajaga 50 ms.Peptiidide jaoks on loodud monoisotoopsete piikide tuvastamine.Piirangu lõdvestamise parameeter seatakse väärtusele Tõene, kui leitakse liiga vähe lähteaineid.Eelkäija minimaalseks ioontugevuseks määrati 5,0e3 ja katsetesse kaasati prekursori laengu olekud kuni +8.
Tsükliajaks suuremate skaneeringute vahel andmete korrelatsioonirežiimis määrati 2,5 sekundit.Dünaamiline massi välistamine määrati 20 sekundiks pärast prekursoriooni esimest killustumist.Eelkäija isolatsiooniaken määrati väärtusele 2 Th.Normaliseeritud kokkupõrkeenergia tüüp fikseeritud kokkupõrkeenergia režiimiga valiti andmetest sõltuvas MS / MS-skaneerimises.Kokkupõrkeenergiaks on seatud 30%.Orbitrapi eraldusvõimeks määrati 15 000 ja AGC sihtmärgiks 100%.Kohandatud maksimaalne süstimisaeg on seatud 60 millisekundile.
Enne valgu-valgu võrgu jälgimist ristseotud proovides töötlesime toorfaile MaxQuant paketi (versioon 1.6.12.0)26,27 abil, et tuvastada proovides jälgitavad peptiidid/valgud.Lisaks viidi sarnased proteoomilised analüüsid läbi IFNa-ga töödeldud ja töötlemata ristseotud Flo-1 proovidega.MS/MS andmeid otsiti UniProti inimeste andmebaasist (www.uniprot.org) (üles laaditud 12. august 2020, sisaldab 75 093 kirjet), kasutades sisseehitatud otsingumootorit Andromeda27.Otsing viidi läbi ilma ensüümi spetsiifilisust ja erinevaid deamidatsiooni (N, Q) ja oksüdatsiooni (M) modifikatsioone näitamata.Prekursori massi tolerantsiks määrati 20 ppm ja produktiioonide väärtuseks 0,02 Da.Algseks ja maksimaalseks massihälbeks määrati 10 ppm.Peptiidi maksimaalseks massiks määrati 4600 Da ja järjestuse sarnasus määrati 7 ja 25 aminohappe (aa) vahele.Edasine statistiline analüüs viidi läbi programmi Perseus (versioon 1.6.10.45) abil.Valgusisaldus arvutati valgu spektraalse intensiivsuse normaliseerimise teel (LFQ intensiivsus; märgistamata kvantifitseerimine)27 ja intensiivsuse väärtused teisendati Log2-ks.Nende peptiidide intensiivsuse järgi identifitseeritud valkude hierarhiline klaster koostati, kasutades R-i (v 4.1.2) paketti pheatmap (v1.0.12).Raja rikastamise analüüs viidi läbi, kasutades Reactome raja andmebaasi IFNα-ga töödeldud valkude jaoks, mis olid rohkem kui neli korda aktiveeritud võrreldes töötlemata proovidega.
Valgukomplekside lüsiini (K) või seriini (S) spetsiifiliste keemiliste ristsidemete tuvastamine, mida jälgiti LC-MS/MS abil, viidi läbi, kasutades ristseotud peptiidide (SIM-XL) spektroskoopilist identifitseerimismasinat (SIM-XL)29.Esiteks uuriti võimalikke koostoimeid interferooniga seotud (IFN) DNA kahjustusresistentsuse allkirja (IRDS) geenide vahel, kasutades IRDS-valgu andmestikku, mida on kirjeldanud Padariya et al.28.Kogu inimese UniProti kõigi seisundite ja korduste sõelumine on arvutusmahukas, seega kogu inimese UniProti andmebaas (www.uniprot.org) (allalaaditud 12. augustil 2020, sisaldab 75 093 kirjet) IFNα-ga töödeldud korduste vastu.Üks filtritest kõrge usaldusväärsusega suhtlemiseks.
SIM-XL-is kasutati ristsildaja (XL) jaoks DSS-i ning XL-i kaalu nihe ja modifikatsiooni kaalu nihe määrati vastavalt väärtusele 138,06 ja 156,07.Arvesse võetakse järgmisi ristsidumise reaktsioonikohti: KK, KS ja KN-TERM, ilma reporterioonideta.Nii prekursori kui ka fragmendi ppm määrati väärtusele 20 ja Xrea läviväärtuseks määrati 0,15.XCorr dünaamilise DB vähendamise lävi ja peptiidide minimaalne arv dünaamilise DB vähendamise jaoks määrati vastavalt 2,5 ja 2-le.Teised parameetrid on: monoisotoobi tõenäosus ja piigi kokkulangevuse piir, minimaalselt 4 AA jääki ahela kohta ja maksimaalne ahela laeng ning 3 maksimaalset vahelejäänud lõhenemist.Saadud õmmeldud 2D-kaarte analüüsiti (SIM-XL) ja 2D-kaartide koostamiseks kasutati xQuest28 graafilist esitust.Valkude ristsidemed valgustruktuuridel on saadaval PyMolis (PyMOL Molecular Graphics System, versioon 2.0 Schrödinger, LLC).
Valgumudeli struktuurid loodi Phyre2 serveri (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 abil, kasutades homoloogia modelleerimise põhimõtteid ja “Varjatud Markovi meetodi” rakendamist.Phyre2 genereerib mudelstruktuure, mis põhinevad järjestuste joondamisel tuntud valgustruktuuridega.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 ja MDN1 valkude jaoks kasutati matriitsi struktuure 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 ja 6i2665.Lisaks võeti arvesse ka AlphaFold71 MX1, UBP18 ja ROBO1 struktuuri.Valgu struktuuri visualiseerimiseks kasutati paketti BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) ja Molecular Operating Environment paketti (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).