Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Kasutate piiratud CSS-i toega brauseri versiooni.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Lisaks näitame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiilide ja JavaScriptita.
Liugurid, mis näitavad kolme artiklit slaidi kohta.Kasutage slaidide vahel liikumiseks nuppu Tagasi ja Järgmine või igal slaidil liikumiseks lõpus olevaid slaidijuhtnuppe.

317 roostevabast terasest spiraaltorude tarnijad

Roostevabast terasest materjali keemilise koostise tabel

SPACA6 on sperma ekspresseeritud pinnavalk, mis on imetajate seksuaalse paljunemise ajal ülioluline sugurakkude sulandumise jaoks.Vaatamata sellele põhirollile on SPACA6 spetsiifiline funktsioon halvasti mõistetav.Selgitame SPACA6 ekstratsellulaarse domeeni kristallstruktuuri eraldusvõimega 2, 2 Å, paljastades kahedomeenilise valgu, mis koosneb neljaahelalisest kimbust ja Ig-sarnastest β-võileibadest, mis on ühendatud kvaasipainduvate linkeritega.See struktuur sarnaneb IZUMO1-ga, mis on veel üks sugurakkude fusiooniga seotud valk, mis teeb SPACA6 ja IZUMO1 väetamisega seotud valkude superperekonna asutajaliikmeteks, mida siin nimetatakse IST superperekonnaks.IST superperekond on struktuurselt määratletud selle keerutatud nelja heeliksi kimbu ja paari disulfiidseotud CXXC motiiviga.Inimese proteoomi struktuuripõhine AlphaFoldi otsing tuvastas selle superperekonna täiendavad valguliikmed;Eelkõige osalevad paljud neist valkudest sugurakkude liitmises.SPACA6 struktuur ja selle seos teiste IST superperekonna liikmetega on puuduv lüli meie teadmistes imetajate sugurakkude sulandumise kohta.
Iga inimese elu algab kahe eraldiseisva haploidse sugurakuga: isa sperma ja ema munarakuga.See sperma võidab intensiivse selektsiooniprotsessi, mille käigus miljonid seemnerakud läbivad naiste suguelundeid, ületavad erinevaid takistusi1 ja läbivad mahtuvuse, mis suurendab nende liikuvust ja pinnakomponentide protsessi2,3,4.Isegi kui sperma ja munarakk teineteist leiavad, pole protsess veel lõppenud.Ootsüüti ümbritseb kummulirakkude kiht ja glükoproteiinibarjäär, mida nimetatakse zona pellucidaks, mille kaudu peavad spermatosoidid munarakku sisenemiseks läbima.Spermatosoidid kasutavad nende lõplike tõkete ületamiseks pinna adhesioonimolekulide ja membraaniga seotud ja sekreteeritud ensüümide kombinatsiooni5.Neid molekule ja ensüüme hoitakse peamiselt sisemembraanis ja akrosomaalses maatriksis ning need tuvastatakse, kui sperma välimine membraan lüüsitakse akrosomaalse reaktsiooni käigus6.Selle intensiivse teekonna viimane samm on sperma-muna sulandumine, mille käigus kaks rakku ühendavad oma membraanid üheks diploidseks organismiks7.Kuigi see protsess on inimeste paljunemises murranguline, on vajalikud molekulaarsed vastasmõjud halvasti mõistetavad.
Lisaks sugurakkude viljastamisele on põhjalikult uuritud kahe lipiidide kaksikkihi ühinemise keemiat.Üldiselt on membraanide liitmine energeetiliselt ebasoodne protsess, mis nõuab, et valgukatalüsaator läbiks struktuurse konformatsioonimuutuse, mis lähendab kaks membraani üksteisele, katkestades nende järjepidevuse ja põhjustades sulandumise 8, 9.Neid valgukatalüsaatoreid tuntakse fusogeenidena ja neid on leitud lugematutest liitsüsteemidest.Need on vajalikud viiruse sisenemiseks peremeesrakkudesse (nt gp160 HIV-1-s, teravik koronaviirustes, hemaglutiniin gripiviirustes)10, 11, 12 platsenta (süntsütiin)13, 14, 15 ja sugurakke moodustavate fusioonide jaoks madalamates eukarüootides ( HAP2/GCS1 taimedes, protistides ja lülijalgsetes) 16,17,18,19.Inimese sugurakkude fusogeenid on veel avastamata, kuigi on näidatud, et mitmed valgud on sugurakkude kinnitumise ja sulandumise jaoks kriitilised.Esimesena avastati munarakkudes ekspresseeritud CD9, transmembraanne valk, mis on vajalik hiire ja inimese sugurakkude liitmiseks 21, 22, 23.Kuigi selle täpne funktsioon jääb ebaselgeks, näib selle roll adhesioonis, munarakkude mikrovilli adhesioonikolde struktuuris ja/või munarakkude pinnavalkude õiges lokaliseerimises tõenäoline 24, 25, 26.Kaks kõige tüüpilisemat valku, mis on sugurakkude sulandumise jaoks kriitilised, on sperma valk IZUMO127 ja munaraku valk JUNO28 ning nende vastastikune seos on oluline samm sugurakkude äratundmisel ja adhesioonil enne sulandumist.Isased Izumo1 knockout hiired ja emased Juno knockout hiired on täiesti steriilsed, nendes mudelites sisenevad spermatosoidid perivitelliini ruumi, kuid sugurakud ei sulandu.Samamoodi vähenes konfluentsus, kui sugurakke töödeldi IZUMO1 või JUNO27,29-vastaste antikehadega inimese in vitro viljastamise katsetes.
Hiljuti avastati äsja avastatud sperma ekspresseeritud valkude rühm, mis on fenotüübiliselt sarnane IZUMO1 ja JUNO20, 30, 31, 32, 33, 34, 35-ga.Suuremahulises hiire mutageneesi uuringus on tuvastatud sperma akrosomaalse membraaniga seotud valk 6 (SPACA6) viljastamiseks hädavajalikuna.Transgeeni sisestamine geeni Spaca6 toodab mittesulanduvaid spermatosoide, kuigi need spermatosoidid imbuvad perivitelliini ruumi36.Hiirtel läbi viidud knockout-uuringud kinnitasid, et sugurakkude liitmiseks on vaja Spaca6 30,32.SPACA6 ekspresseerub peaaegu eranditult munandites ja selle lokaliseerimismuster on sarnane IZUMO1 omaga, nimelt spermatosoidide sisemuses enne akrosomaalset reaktsiooni ja seejärel migreerub pärast akrosomaalset reaktsiooni ekvatoriaalpiirkonda 30, 32.Spaca6 homoloogid eksisteerivad mitmesugustel imetajatel ja teistel eukarüootidel 30 ning selle tähtsust inimese sugurakkude ühinemisel on demonstreeritud inimese viljastamise inhibeerimisega in vitro SPACA6 30 resistentsuse tõttu.Erinevalt IZUMO1-st ja JUNO-st jäävad SPACA6 struktuuri, interaktsioonide ja funktsiooni üksikasjad ebaselgeks.
Et paremini mõista inimese sperma ja munarakkude sulandumise aluseks olevat põhiprotsessi, mis võimaldab meil teavitada pereplaneerimise ja viljakusravi tulevasi arenguid, viisime läbi SPACA6 struktuuri- ja biokeemilised uuringud.SPACA6 ekstratsellulaarse domeeni kristallstruktuur näitab nelja-spiraalset kimpu (4HB) ja immunoglobuliinitaolist (Ig-sarnast) domeeni, mis on ühendatud kvaasipainduvate piirkondadega.Nagu varasemates uuringutes ennustatud 7, 32, 37, on SPACA6 domeenistruktuur sarnane inimese IZUMO1 omaga ja neil kahel valgul on ebatavaline motiiv: kolmnurkse spiraalse pinnaga 4HB ja paar disulfiidiga seotud CXXC motiivi.Teeme ettepaneku, et IZUMO1 ja SPACA6 määratleksid nüüd suurema, struktuurselt seotud sugurakkude liitmisega seotud valkude superperekonna.Kasutades superperekonnale ainulaadseid funktsioone, viisime läbi põhjaliku AlphaFoldi struktuurse inimese proteoomi otsingu, tuvastades selle superperekonna täiendavad liikmed, sealhulgas mitmed sugurakkude sulandumise ja/või viljastamisega seotud liikmed.Nüüd näib, et sugurakkude sulandumisega on seotud ühine struktuurne volt ja valkude superperekond ning meie struktuur annab molekulaarse kaardi inimese sugurakkude fusioonimehhanismi selle olulise aspekti kohta.
SPACA6 on ühe läbipääsuga transmembraanne valk, millel on üks N-seotud glükaan ja kuus oletatavat disulfiidsidet (joonised S1a ja S2).Me väljendatud ekstratsellulaarse domeeni inimese SPACA6 (jäägid 27-246) Drosophila S2 rakkudes ja puhastatud valgu kasutades nikli afiinsus, katioonvahetus ja suurus välistamine kromatograafia (joonis S1b).Puhastatud SPACA6 ektodomeen on väga stabiilne ja homogeenne.Suuruskromatograafia ja hulknurkse valguse hajumise (SEC-MALS) analüüs näitas, et üks piik arvutatud molekulmassiga oli 26,2 ± 0,5 kDa (joonis S1c).See on kooskõlas SPACA6 monomeerse ektodomeeni suurusega, mis näitab, et oligomeriseerumist puhastamise ajal ei toimunud.Lisaks näitas ringdikroism (CD) spektroskoopia segatud α/β struktuuri sulamistemperatuuriga 51,3 °C (joonis S1d, e).CD spektrite dekonvolutsioon näitas 38, 6% α-spiraalseid ja 15, 8% β-ahelalisi elemente (joonis S1d).
SPACA6 ektodomeen kristalliseeriti juhusliku maatriksi külvamise abil38, mille tulemuseks oli andmekogum eraldusvõimega 2, 2 Å (tabel 1 ja joonis S3).Kasutades struktuuri määramiseks fragmendipõhiste molekulaarsete asenduste ja SAD-faasiandmete kombinatsiooni bromiidi kokkupuutega (tabel 1 ja joonis S4), koosneb lõplik täpsustatud mudel jääkidest 27–246.Struktuuri määramise ajal ei olnud eksperimentaalseid ega AlphaFoldi struktuure saadaval.SPACA6 ektodomeeni mõõtmed on 20 Å × 20 Å × 85 Å, see koosneb seitsmest heeliksist ja üheksast β-ahelast ning sellel on piklik tertsiaarne volt, mis on stabiliseeritud kuue disulfiidsidemega (joonis 1a, b).Nõrk elektrontihedus Asn243 külgahela lõpus näitab, et see jääk on N-seotud glükosüülimine.Struktuur koosneb kahest domeenist: N-terminaalsest nelja heeliksi kimbust (4HB) ja C-terminaalsest Ig-taolisest domeenist, mille vahel on vahepealne hingepiirkond (joonis 1c).
SPACA6 ekstratsellulaarse domeeni struktuur.SPACA6 ekstratsellulaarse domeeni ribadiagramm, ahela värvus N-st C-otsani tumesinisest tumepunaseni.Disulfiidsidemetes osalevad tsüsteiinid on esile tõstetud magenta värviga.b SPACA6 ekstratsellulaarse domeeni topoloogia.Kasutage sama värviskeemi nagu joonisel 1a.c SPACA6 rakuväline domeen.4HB, hinge ja Ig-sarnaste domeenide ribakaardid on vastavalt oranži, rohelise ja sinise värviga.Kihid ei ole mõõtkavas joonistatud.
SPACA6 4HB domeen sisaldab nelja peamist spiraali (heeliksid 1–4), mis on paigutatud spiraalse heeliksi kujul (joonis 2a), vaheldumisi antiparalleelsete ja paralleelsete interaktsioonidega (joonis 2b).Kimbuga risti asetatakse väike täiendav ühe pöördega spiraal (heeliks 1′), mis moodustab kolmnurga spiraalidega 1 ja 2. See kolmnurk on suhteliselt tiheda spiraali 3 ja 4 tihendi spiraalselt keeratud tihendis veidi deformeerunud ( joonis 2a).
4HB N-klemmi ribakaart.b Pealtvaade neljast spiraalist koosnevast kimbust, iga spiraal on N-otsas esile tõstetud tumesinisega ja C-otsas tumepunane.c 4HB ülalt-alla spiraalrataste diagramm, kus iga jääk on näidatud ringina, mis on märgistatud ühetähelise aminohappekoodiga;ainult neli aminohapet ratta ülaosas on nummerdatud.Mittepolaarsed jäägid on värvitud kollaseks, polaarsed laenguta jäägid on värvitud roheliseks, positiivselt laetud jäägid siniseks ja negatiivselt laetud jäägid punaseks.d 4HB domeeni kolmnurksed küljed, 4HBd oranžid ja hinged rohelised.Mõlemal sisendil on vardakujulised disulfiidsidemed.
4HB on kontsentreeritud sisemisele hüdrofoobsele tuumale, mis koosneb peamiselt alifaatsetest ja aromaatsetest jääkidest (joonis 2c).Südamik sisaldab disulfiidsidet Cys41 ja Cys55 vahel, mis seob heeliksid 1 ja 2 kokku ülemises tõstetud kolmnurgas (joonis 2d).Kaks täiendavat disulfiidsidemed moodustati CXXC motiivi vahel Helix 1' ja teise CXXC motiivi vahel, mis leiti β-juuksenõela otsas hingepiirkonnas (joonis 2d).Tundmatu funktsiooniga konservatiivne arginiinijääk (Arg37) paikneb õõnsas kolmnurgas, mille moodustavad heeliksid 1', 1 ja 2. Alifaatsed süsinikuaatomid Cβ, Cγ ja Cδ Arg37 interakteeruvad hüdrofoobse tuumaga ning selle guanidiinirühmad liiguvad tsükliliselt vahel heeliksid 1 'ja 1 kaudu interaktsioonid Thr32 selgroog ja külgahela (joonis S5a, b).Tyr34 ulatub õõnsusse, jättes kaks väikest õõnsust, mille kaudu Arg37 saab lahustiga suhelda.
Ig-sarnased β-sandwich-domeenid on suur valkude superperekond, millel on kahe või enama mitmeahelalise amfipaatse β-lehe ühiseks tunnuseks, mis interakteeruvad hüdrofoobse südamiku kaudu 39. SPACA6 C-otsa Ig-sarnasel domeenil on sama muster. ja koosneb kahest kihist (joonis S6a).Leht 1 on neljast ahelast (ahelad D, F, H ja I) koosnev β-leht, kus ahelad F, H ja I moodustavad antiparalleelse paigutuse ning ahelad I ja D saavad paralleelse interaktsiooni.Tabel 2 on väike antiparalleelne kaheahelaline beetaleht (ahelad E ja G).Sisemist disulfiidsidet täheldati E-ahela C-otsa ja H-ahela keskpunkti vahel (Cys170-Cys226) (joonis S6b).See disulfiidside on analoogne disulfiidsidemega immunoglobuliini β-sandwich-domeenis40,41.
Nelja ahelaga β-leht keerdub kogu pikkuses, moodustades asümmeetrilised servad, mis erinevad kuju ja elektrostaatika poolest.Õhem serv on tasane hüdrofoobne keskkonnapind, mis paistab silma SPACA6 ülejäänud ebaühtlaste ja elektrostaatiliselt mitmekesiste pindadega (joonis S6b, c).Hüdrofoobset pinda ümbritseb paljastatud karkassi karbonüül- / aminorühmade ja polaarsete külgahelate halo (joonis S6c).Laiem marginaal on kaetud kaetud spiraalse segmendiga, mis blokeerib hüdrofoobse südamiku N-terminaalse osa ja moodustab kolm vesiniksidemeid F-ahela karkassi avatud polaarse rühmaga (joonis S6d).Selle serva C-otsa osa moodustab suure tasku, millel on osaliselt avatud hüdrofoobne südamik.Taskut ümbritsevad positiivsed laengud, mis on tingitud kolmest kahekordsest arginiinijäägist (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ja Arg212-Arg214) ja tsentraalsest histidiinist (His220) (joonis S6e).
Hingepiirkond on lühike segment spiraalse domeeni ja Ig-sarnase domeeni vahel, mis koosneb ühest antiparalleelsest kolmeahelalisest β-kihist (ahelad A, B ja C), väikesest 310 heeliksist ja mitmest pikast juhuslikust spiraalsest segmendist.(joonis S7).Kovalentsete ja elektrostaatiliste kontaktide võrk hingepiirkonnas näib stabiliseerivat orientatsiooni 4HB ja Ig-sarnase domeeni vahel.Võrgu võib jagada kolmeks osaks.Esimene osa sisaldab kahte CXXC motiivi (27CXXC30 ja 139CXXC142), mis moodustavad hinges oleva β-juuksenõela ja 4HB 1'-heeliksi vahel disulfiidsideme.Teine osa sisaldab elektrostaatilisi interaktsioone Ig-sarnase domeeni ja hinge vahel.Hinges olev Glu132 moodustab soolasilla Arg233-ga Ig-sarnases domeenis ja Arg135-ga hinges.Kolmas osa sisaldab kovalentset sidet Ig-sarnase domeeni ja liigendpiirkonna vahel.Kaks disulfiidsidet (Cys124-Cys147 ja Cys128-Cys153) ühendavad liigendsilmuse linkeriga, mida stabiliseerivad elektrostaatilised interaktsioonid Gln131 ja selgroo funktsionaalrühma vahel, võimaldades juurdepääsu esimesele Ig-sarnasele domeenile.kett.
Struktuuriliselt sarnaste kirjete otsimiseks valgu andmebaasidest kasutati SPACA6 ektodomeeni struktuuri ning 4HB ja Ig-sarnaste domeenide üksikuid struktuure 42 .Tuvastasime vasted kõrgete Dali Z skooridega, väikeste standardhälvetega ja suurte LALI skooridega (viimane on struktuurselt samaväärsete jääkide arv).Kui ektodomeeni täieliku otsingu esimese 10 tabamuse (tabel S1) vastuvõetav Z-skoor oli >842, näitas ainuüksi 4HB või Ig-laadse domeeni otsing, et enamik neist tabamustest vastas ainult β-võileibadele.kõikjal esinev volt, mida leidub paljudes valkudes.Kõik kolm Dali otsingut andsid ainult ühe tulemuse: IZUMO1.
Pikka aega on väidetud, et SPACA6 ja IZUMO1 jagavad struktuurseid sarnasusi 7, 32, 37.Kuigi nende kahe suguraku fusiooniga seotud valgu ektodomeenidel on ainult 21% järjestuse identsus (joonis S8a), võimaldasid keerulised tõendid, sealhulgas konserveerunud disulfiidsideme muster ja ennustatud C-terminaalne Ig-sarnane domeen SPACA6-s varakult luua A a SPACA6 hiire homoloogiamudel, kasutades mallina IZUMO137.Meie struktuur kinnitab neid ennustusi ja näitab tegelikku sarnasuse määra.Tegelikult SPACA6 ja IZUMO137, 43, 44 struktuurid jagavad sama kahe domeeni arhitektuuri (joonis S8b) sarnaste 4HB ja Ig-like β-sandwich domeenid ühendatud hinge piirkonnas (joonis S8c).
IZUMO1 ja SPACA6 4HB erinevad tavapärastest spiraalkimpudest.Tüüpilistel 4HB-del, nagu need, mida leidub endosomaalses fusioonis osalevates SNARE valgukompleksides 45, 46, on ühtlaselt paigutatud spiraalid, mis säilitavad konstantse kõveruse ümber kesktelje 47. Seevastu nii IZUMO1 kui ka SPACA6 spiraalsed domeenid olid moonutatud, muutuva kõverusega ja ebaühtlane pakkimine (joonis S8d).Tõenäoliselt spiraalide 1′, 1 ja 2 moodustatud kolmnurga poolt põhjustatud keerdumine säilib IZUMO1 ja SPACA6 ning stabiliseerub sama CXXC motiiviga spiraalil 1′.Kuid SPACA6-s leitud täiendav disulfiidside (Cys41 ja Cys55, mis ühendavad kovalentselt ülalpool olevaid spiraale 1 ja 2) loob kolmnurga tipus teravama tipu, muutes SPACA6 rohkem keerduvaks kui IZUMO1, kusjuures õõnsuse kolmnurgad on rohkem väljendunud.Lisaks puudub IZUMO1-l SPACA6 selle õõnsuse keskel täheldatud Arg37.Seevastu IZUMO1-l on tüüpilisem alifaatsete ja aromaatsete jääkide hüdrofoobne tuum.
IZUMO1-l on Ig-sarnane domeen, mis koosneb kaheahelalisest ja viieahelalisest β-lehest43.IZUMO1 lisaahel asendab SPACA6 mähist, mis interakteerub F-ahelaga, et piirata ahelas olevaid vesiniksidemeid.Huvitav võrdlusmoment on kahe valgu Ig-sarnaste domeenide prognoositav pinnalaeng.IZUMO1 pind on negatiivsemalt laetud kui SPACA6 pind.Lisalaeng asub sperma membraani poole suunatud C-otsa lähedal.SPACA6-s olid samad piirkonnad neutraalsemad või positiivselt laetud (joonis S8e).Näiteks SPACA6 hüdrofoobne pind (õhemad servad) ja positiivselt laetud süvendid (laiemad servad) on IZUMO1-s negatiivselt laetud.
Kuigi suhe ja sekundaarse struktuuri elemendid IZUMO1 ja SPACA6 vahel on hästi säilinud, näitas Ig-sarnaste domeenide struktuurne joondamine, et need kaks domeeni erinevad oma üldise orientatsiooni poolest üksteise suhtes (joonis S9).IZUMO1 spiraalne kimp on kõverdatud β-võileiva ümber, luues eelnevalt kirjeldatud "bumerangi" kuju umbes 50 ° nurga all keskteljest.Seevastu SPACA6 spiraalne tala oli kallutatud umbes 10 ° vastupidises suunas.Nende suundade erinevused on tõenäoliselt tingitud hingepiirkonna erinevustest.Primaarse järjestuse tasemel on IZUMO1 ja SPACA6 liigendil väike järjestuste sarnasus, välja arvatud tsüsteiini, glütsiini ja asparagiinhappe jäägid.Sellest tulenevalt on vesiniksidemed ja elektrostaatilised võrgud täiesti erinevad.β-lehe sekundaarse struktuuri elemente jagavad IZUMO1 ja SPACA6, kuigi IZUMO1 ahelad on palju pikemad ja 310 spiraal (heeliks 5) on SPACA6 jaoks ainulaadne.Need erinevused põhjustavad kahe muidu sarnase valgu erineva domeeni orientatsiooni.
Meie Dali serveri otsing näitas, et SPACA6 ja IZUMO1 on ainsad kaks valgu andmebaasis salvestatud eksperimentaalselt määratud struktuuri, millel on see konkreetne 4HB volt (tabel S1).Hiljuti töötas DeepMind (Alphabet/Google) välja AlphaFoldi, närvivõrgupõhise süsteemi, mis suudab primaarsetest järjestustest pärinevate valkude 3D-struktuure täpselt ennustada48.Vahetult pärast SPACA6 struktuuri lahendamist vabastati AlphaFoldi andmebaas, mis pakub ennustavaid struktuurimudeleid, mis katavad 98, 5% kõigist inimese proteoomi valkudest48, 49.Kasutades meie lahendatud SPACA6 struktuuri otsingumudelina, tuvastas AlphaFoldi inimese proteoomi mudeli struktuurne homoloogiaotsing kandidaadid, millel on võimalikud struktuurilised sarnasused SPACA6 ja IZUMO1-ga.Arvestades AlphaFoldi uskumatut täpsust SPACA6 ennustamisel (joonis S10a) - eriti 1,1 Å rms ektodomeeni võrreldes meie lahendatud struktuuriga (joonis S10b) - võime olla kindlad, et tuvastatud SPACA6 vasted on tõenäoliselt täpsed.
Varem otsis PSI-BLAST IZUMO1 klastrit koos kolme teise spermaga seotud valguga: IZUMO2, IZUMO3 ja IZUMO450.AlphaFold ennustas, et need IZUMO perekonna valgud voldivad 4HB domeeniks sama disulfiidsideme mustriga nagu IZUMO1 (joonised 3a ja S11), kuigi neil puudub Ig-sarnane domeen.Oletatakse, et IZUMO2 ja IZUMO3 on ühepoolsed membraanivalgud, mis on sarnased IZUMO1-ga, samas kui IZUMO4 näib olevat sekreteeritud.IZUMO 2, 3 ja 4 valkude funktsioonid sugurakkude liitmisel ei ole kindlaks tehtud.On teada, et IZUMO3 mängib spermatosoidide arengu ajal rolli akrosoomi biogeneesis51 ja IZUMO valk moodustab kompleksi50.IZUMO valkude säilimine imetajatel, roomajatel ja kahepaiksetel viitab sellele, et nende potentsiaalne funktsioon on kooskõlas teiste teadaolevate sugurakkudega liitumisega seotud valkude, nagu DCST1/2, SOF1 ja FIMP, omaga.
IST superperekonna domeeniarhitektuuri skeem, 4HB, hinge ja Ig-sarnased domeenid on esile tõstetud vastavalt oranži, rohelise ja sinisega.IZUMO4-l on ainulaadne C-terminali piirkond, mis näeb välja must.Kinnitatud ja oletatavad disulfiidsidemed on näidatud vastavalt pideva ja punktiirjoonega.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F9) (ja AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F9) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) kuvatakse samas värvivahemikus nagu paneel A. Disulfiidsidemed on näidatud magenta värviga.TMEM95, IZUMO2 ja IZUMO3 transmembraanseid spiraale pole näidatud.
Erinevalt IZUMO valgust arvatakse, et teised SPACA valgud (st SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 ja SPACA9) on SPACA6-st struktuurselt erinevad (joonis S12).Ainult SPACA9-l on 4HB, kuid sellel ei ole eeldatavasti sama paralleelset antiparalleelset orientatsiooni ega sama disulfiidsidet kui SPACA6-l.Sarnane Ig-sarnane domeen on ainult SPACA1-l.AlphaFold ennustab, et SPACA3, SPACA4 ja SPACA5 struktuur on täiesti erinev kui SPACA6.Huvitav on see, et SPACA4 mängib teadaolevalt rolli ka viljastamises, kuid suuremal määral kui SPACA6, hõlbustades selle asemel sperma ja munaraku zona pellucida vahelist koostoimet52.
Meie AlphaFoldi otsing leidis teise vaste IZUMO1 ja SPACA6 4HB, TMEM95 jaoks.TMEM95, üks spermaspetsiifiline transmembraanne valk, muudab isased hiired ablatsiooni korral viljatuks 32, 33.Spermatosoididel, millel puudus TMEM95, oli normaalne morfoloogia, liikuvus ja võime tungida läbi zona pellucida ja seonduda munamembraaniga, kuid ei suutnud munaraku membraaniga sulanduda.Varasemad uuringud on näidanud, et TMEM95 jagab struktuurseid sarnasusi IZUMO133-ga.Tõepoolest, AlphaFoldi mudel kinnitas, et TMEM95 on 4HB, millel on sama paar CXXC motiive nagu IZUMO1 ja SPACA6 ning sama täiendav disulfiidside heeliksite 1 ja 2 vahel, mis leiti SPACA6-s (joonis 3a ja S11).Kuigi TMEM95-l puudub Ig-sarnane domeen, on sellel piirkond, mille disulfiidsideme muster sarnaneb SPACA6 ja IZUMO1 hingepiirkondadega (joonis 3b).Selle käsikirja avaldamise ajal teatas eeltrükiserver TMEM95 struktuurist, kinnitades AlphaFold53 tulemust.TMEM95 on väga sarnane SPACA6 ja IZUMO1-ga ning on evolutsiooniliselt konserveerunud juba kahepaiksetel (joonis 4 ja S13).
PSI-BLAST otsingus kasutati NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP ja SOF1 andmebaase, et määrata nende järjestuste asukoht elupuus.Hargnemispunktide vahelisi kaugusi ei kuvata mõõtkavas.
Silmatorkav üldine struktuurne sarnasus SPACA6 ja IZUMO1 vahel viitab sellele, et nad on konserveerunud struktuurse superperekonna asutajad, mis hõlmavad valke TMEM95 ja IZUMO 2, 3 ja 4.teadaolevad liikmed: IZUMO1, SPACA6 ja TMEM95.Kuna ainult vähestel liikmetel on Ig-sarnased domeenid, on IST superperekonna tunnuseks 4HB domeen, millel on kõikidele nendele valkudele ühised ainulaadsed omadused: 1) keerdunud 4HB, mille heeliksid on paigutatud anti-paralleelselt/paralleelselt (joonis 1). 5a), 2) kimbul on kolmnurkne külg, mis koosneb kahest kimbu sees olevast spiraalist ja kolmandast vertikaalsest heeliksist (joonis klahvipiirkond (joonis 5c). Tioredoksiinitaolistes valkudes leiduv CXXC motiiv toimib teadaolevalt redokssensorina 54, 55, 56 , samas kui IST perekonnaliikmete motiivi võib sugurakkude liitmisel seostada valgu disulfiidisomeraasidega, nagu ERp57. Rollid on seotud 57, 58.
IST superperekonna liikmed on määratletud 4HB domeeni kolme iseloomuliku tunnusega: neli heeliksit, mis vahelduvad paralleelse ja antiparalleelse orientatsiooni vahel, ba-kolmnurksed spiraalsed kimbupinnad ja väikeste molekulide vahel moodustunud ca CXXC topeltmotiiv.) N-otsa spiraalid (oranž) ja hingepiirkond β-juuksenõel (roheline).
Arvestades SPACA6 ja IZUMO1 sarnasust, testiti esimese võimet seonduda IZUMO1 või JUNOga.Biokihi interferomeetria (BLI) on kineetikal põhinev sidumismeetod, mida on varem kasutatud IZUMO1 ja JUNO vahelise interaktsiooni kvantifitseerimiseks.Pärast biotiiniga märgistatud anduri inkubeerimist IZUMO1-ga söödana, milles oli kõrge JUNO analüüdi kontsentratsioon, tuvastati tugev signaal (joonis S14a), mis viitab sidumisest põhjustatud muutusele anduri otsa külge kinnitatud biomaterjali paksuses.Sarnased signaalid (st anduriga ühendatud JUNO söödana IZUMO1 analüüdi vastu) (joonis S14b).Signaali ei tuvastatud, kui SPACA6 kasutati analüüdina anduriga seotud IZUMO1 või anduriga seotud JUNO vastu (joonis S14a, b).Selle signaali puudumine näitab, et SPACA6 ekstratsellulaarne domeen ei interakteeru IZUMO1 või JUNO rakuvälise domeeniga.
Kuna BLI test põhineb söödavalgu vabade lüsiinijääkide biotinüülimisel, võib see modifikatsioon takistada seondumist, kui interaktsioonis osalevad lüsiinijäägid.Lisaks võib sidumise orientatsioon anduri suhtes tekitada steerilisi takistusi, nii et tavapärased allatõmmatavad testid viidi läbi ka rekombinantsete SPACA6, IZUMO1 ja JUNO ektodomeenidega.Sellele vaatamata SPACA6 ei sadestunud His-märgistatud IZUMO1 või His-märgistatud JUNOga (joonis S14c, d), mis näitab, et BLI-katsetes täheldatuga pole kooskõlas olevat koostoimet.Positiivse kontrollina kinnitasime JUNO koostoimet märgistatud His IZUMO1-ga (joonised S14e ja S15).
Vaatamata SPACA6 ja IZUMO1 struktuurilisele sarnasusele, pole SPACA6 võimetus JUNO-d siduda üllatav.Inimese IZUMO1 pinnal on rohkem kui 20 jääki, mis interakteeruvad JUNOga, sealhulgas jäägid igast kolmest piirkonnast (kuigi enamik neist asuvad hinge piirkonnas) (joonis S14f).Nendest jääkidest on ainult üks säilinud SPACA6-s (Glu70).Kuigi paljud jääkide asendused säilitasid oma esialgsed biokeemilised omadused, asendati oluline Arg160 jääk IZUMO1-s SPACA6-s negatiivselt laetud Asp148-ga;varasemad uuringud on näidanud, et Arg160Glu mutatsioon IZUMO1-s kaotab peaaegu täielikult seondumise JUNO43-ga.Lisaks suurendas erinevus domeenide orientatsioonis IZUMO1 ja SPACA6 vahel märkimisväärselt SPACA6 samaväärse piirkonna JUNO-sidumissaidi pindala (joonis S14g).
Vaatamata teadaolevale vajadusele SPACA6 järele sugurakkude liitmiseks ja selle sarnasusele IZUMO1-ga, ei näi SPACA6-l olevat samaväärset JUNO sidumisfunktsiooni.Seetõttu oleme püüdnud ühendada oma struktuuriandmed evolutsioonilise bioloogia pakutavate tõenditega.SPACA6 homoloogide järjestuste joondamine näitab ühise struktuuri säilimist väljaspool imetajaid.Näiteks esinevad tsüsteiinijäägid isegi kauges suguluses kahepaiksetes (joonis 6a).ConSurfi serveri abil kaardistati SPACA6 pinnale 66 järjestuse mitme järjestuse joondamise säilitamise andmed.Seda tüüpi analüüs võib näidata, millised jäägid on valgu evolutsiooni ajal konserveerunud, ja võib näidata, millised pinnapiirkonnad mängivad funktsioonis rolli.
CLUSTAL OMEGA abil valmistatud 12 erineva liigi SPACA6 ektodomeenide järjestuste joondamine.ConSurfi analüüsi järgi on kõige konservatiivsemad positsioonid märgitud sinisega.Tsüsteiinijäägid on punasega esile tõstetud.Domeeni piirid ja sekundaarse struktuuri elemendid on näidatud joonduse ülaosas, kus nooled tähistavad β-ahelaid ja lained tähistavad spiraale.Järjestusi sisaldavad NCBI juurdepääsuidentifikaatorid on: inimene (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kaputsiin ahv (Cebus mimic, XP_017359366), hobune (Equus caballus), hobune (Equus caballus, 206 w01223) XP_032_034) .), lammas (Ovis aries, XP_014955560), elevant (Loxodonta africana, XP_010585293), koer (Canis lupus familyis, XP_025277208), hiir (Mus musculus, NP_001156381, NP_001156381), Tasmanian Devillus ), Platypus, 8) , 61_89 ja Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Nummerdamine põhineb inimeste järjestusel.b SPACA6 struktuuri pinnaesitus, ülaosas 4HB ja allosas Ig-sarnane domeen, värvid põhinevad ConSurfi serveri looduskaitsehinnangutel.Kõige paremini säilinud osad on sinised, keskmiselt säilinud osad on valged ja kõige vähem säilinud on kollased.lilla tsüsteiin.Kolm kõrget kaitsetaset demonstreerivat pinnaplaastrit on näidatud tähistega 1, 2 ja 3. Paremal ülaosas on näidatud 4HB koomiks (sama värviskeem).
SPACA6 struktuuril on kolm väga konserveerunud pinnapiirkonda (joonis 6b).Plaaster 1 hõlmab 4HB ja hingepiirkonda ning sisaldab kahte konserveerunud CXXC disulfiidsilda, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 hingevõrku (joonis S7) ja kolme konserveeritud välimist aromaatset jääki (Phe31, Tyr73, Phe137)).Ig-sarnase domeeni laiem serv (joonis S6e), mis esindab sperma pinnal mitmeid positiivselt laetud jääke.Huvitav on see, et see plaaster sisaldab antikeha epitoopi, mis on varem näidanud, et see häirib SPACA6 30 funktsiooni.Piirkond 3 hõlmab liigendit ja Ig-sarnase domeeni ühte külge;see piirkond sisaldab konserveerunud proliine (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ja väljapoole suunatud polaarseid/laetud jääke.Üllataval kombel on suurem osa 4HB pinnal olevatest jääkidest väga varieeruvad (joonis 6b), kuigi volt on säilinud kogu SPACA6 homoloogi ulatuses (nagu näitab hüdrofoobse kimbu tuuma konservatiivsus) ja väljaspool IST superperekonda.
Kuigi see on SPACA6 väikseim piirkond, kus on kõige vähem tuvastatavaid sekundaarse struktuuri elemente, on paljud liigendpiirkonna jäänused (sealhulgas piirkond 3) SPACA6 homoloogide seas väga konserveerunud, mis võib viidata sellele, et spiraalse kimbu ja β-sandwichi orientatsioon mängib rolli.konservatiivina.Vaatamata ulatuslikele vesiniksidemetele ja elektrostaatilistele võrkudele SPACA6 ja IZUMO1 hingepiirkonnas, võib IZUMO137, 43, 44 mitme lubatud struktuuri joondamisel näha tõendeid sisemise paindlikkuse kohta.Üksikute domeenide joondamine kattus hästi, kuid domeenide orientatsioon üksteise suhtes varieerus keskteljest 50 ° kuni 70 ° (joonis S16).Et mõista SPACA6 konformatsioonilist dünaamikat lahuses, viidi läbi SAXS-i katsed (joonis S17a, b).Ab initio rekonstrueerimine SPACA6 ectodomeen vastas varda kristallstruktuuri (joonis S18), kuigi Kratky krundi näitas teatud paindlikkust (joonis S17b).See konformatsioon on kontrastiks IZUMO1-ga, milles seondumata valk omandab bumerangi kuju nii võres kui ka lahuses43.
Painduva piirkonna spetsiifiliseks tuvastamiseks viidi SPACA6-ga läbi vesinik-deuteeriumivahetuse massispektroskoopia (H-DXMS) ja võrreldi IZUMO143-ga eelnevalt saadud andmetega (joonis 7a, b).SPACA6 on selgelt paindlikum kui IZUMO1, mida näitab kõrgem deuteeriumivahetus kogu struktuuris pärast 100 000 sekundit.Mõlemas struktuuris näitab hingepiirkonna C-otsa osa kõrget vahetustaset, mis tõenäoliselt võimaldab 4HB ja Ig-sarnaste domeenide piiratud pöörlemist üksteise suhtes.Huvitav on see, et SPACA6 hinge C-otsa osa, mis koosneb 147CDLPLDCP154 jäägist, on väga konserveerunud piirkond 3 (joonis 6b), mis võib viidata sellele, et domeenidevaheline paindlikkus on SPACA6 evolutsiooniliselt konserveerunud omadus.Paindlikkuse analüüsi kohaselt näitasid CD termilise sulamisandmed, et SPACA6 (Tm = 51,2 °C) on vähem stabiilne kui IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (joonis S1e ja S19).
a H-DXMS kujutised SPACA6 ja b IZUMO1.Deuteeriumi vahetuse protsent määrati näidatud ajahetkedel.Vesiniku-deuteeriumi vahetuse tasemed on näidatud värviga gradiendi skaalal sinisest (10%) kuni punaseni (90%).Mustad kastid tähistavad suure vahetuse valdkondi.Kristallstruktuuris täheldatud 4HB, hinge ja Ig-sarnase domeeni piirid on näidatud primaarse järjestuse kohal.Deuteeriumi vahetustasemed 10 s, 1000 s ja 100 000 s juures kanti ribadiagrammile, mis asetati SPACA6 ja IZUMO1 läbipaistvatele molekulaarpindadele.Struktuuride osad, mille deuteeriumivahetustase on alla 50%, on värvitud valgeks.Piirkonnad, mille H-DXMS vahetus on üle 50%, on värvitud gradiendi skaalal.
CRISPR/Cas9 ja hiire geeni väljalülitamise geneetiliste strateegiate kasutamine on viinud mitme sperma ja munaraku sidumise ja sulandumise jaoks oluliste tegurite tuvastamiseni.Lisaks IZUMO1-JUNO ja CD9 struktuuri hästi iseloomustatud interaktsioonile jääb enamik sugurakkude liitmisega seotud valke struktuurselt ja funktsionaalselt mõistatuslikuks.SPACA6 biofüüsikaline ja struktuurne iseloomustus on veel üks osa adhesiooni-/fusioonimolekulaarsest puslest viljastamise ajal.
SPACA6 ja teised IST superperekonna liikmed näivad olevat väga konserveerunud nii imetajatel kui ka üksikutel lindudel, roomajatel ja kahepaiksetel;Tegelikult arvatakse, et SPACA6 on isegi sebrakala 59 viljastamiseks vajalik. See jaotus sarnaneb teiste teadaolevate sugurakkude fusiooniga seotud valkudega, nagu DCST134, DCST234, FIMP31 ja SOF132, mis viitab sellele, et need tegurid on HAP2-puudulikud (samuti tuntud kui GCS1) valgud, mis vastutavad paljude protistide katalüütilise aktiivsuse eest., taimed ja lülijalgsed.Viljastatud sulandvalgud 60, 61. Vaatamata tugevale struktuurilisele sarnasusele SPACA6 ja IZUMO1 vahel, põhjustas kumbagi neist valkudest kodeerivate geenide väljalangemine isaste hiirte viljatuse, mis näitab, et nende funktsioonid sugurakkude liitmisel ei dubleerita..Laiemas plaanis pole ükski sulandumise adhesioonifaasis vajalikest teadaolevatest sperma valkudest üleliigne.
Jääb lahtiseks küsimus, kas SPACA6 (ja teised IST superperekonna liikmed) osalevad mängudevahelistes ristmikest, moodustavad intragameetilisi võrgustikke, et värvata olulisi valke fusioonipunktidesse, või võib-olla isegi toimida tabamatute fusogeenidena.Kaasimmunosadestamise uuringud HEK293T rakkudes näitasid koostoimet täispika IZUMO1 ja SPACA632 vahel.Kuid meie rekombinantsed ektodomeenid ei interakteerunud in vitro, mis viitab sellele, et Noda et al.mõlemad olid konstruktist kustutatud (pange tähele IZUMO1 tsütoplasmaatilist saba, mis on osutunud väetamiseks ebavajalikuks62).Teise võimalusena võivad IZUMO1 ja/või SPACA6 nõuda spetsiifilisi sidumiskeskkondi, mida me in vitro ei reprodutseeri, näiteks füsioloogiliselt spetsiifilisi konformatsioone või molekulaarseid komplekse, mis sisaldavad teisi (teadaolevaid või veel avastamata) valke.Kuigi arvatakse, et IZUMO1 ektodomeen vahendab spermatosoidide kinnitumist munarakule perivitelliinruumis, on SPACA6 ektodomeeni eesmärk ebaselge.
SPACA6 struktuur näitab mitmeid konserveerunud pindu, mis võivad olla seotud valgu-valgu interaktsioonidega.CXXC motiiviga vahetult külgnevas hingepiirkonna konserveeritud osas (tähistatud ülalpool plaastriks 1) on mitu väljapoole suunatud aromaatset jääki, mida sageli seostatakse biomolekulide vaheliste hüdrofoobsete ja π-virnastamise interaktsioonidega.Ig-sarnase domeeni laiad küljed (piirkond 2) moodustavad positiivselt laetud soone kõrgelt konserveerunud Arg- ja His-jääkidega ning selle piirkonna vastaseid antikehi on varem kasutatud sugurakkude sulandumise blokeerimiseks30.Antikeha tunneb ära lineaarse epitoobi 212RIRPAQLTHRGTFS225, millel on kolm kuuest arginiinijäägist ja kõrgelt konserveerunud His220.Ei ole selge, kas düsfunktsioon on tingitud nende konkreetsete jääkide või kogu piirkonna blokeerimisest.Selle pilu asukoht β-võileiva C-otsa lähedal näitab cis-interaktsioone naaberseemnerakkude valkudega, kuid mitte munarakkude valkudega.Lisaks võib väga paindliku proliinirikka sasipuntra (sait 3) püsimine hinge sees olla valgu-valgu interaktsiooni koht või tõenäolisem, et see viitab paindlikkuse säilimisele kahe domeeni vahel.Sugu on SPACA6 tundmatu rolli jaoks oluline.sugurakkude liitmine.
SPACA6-l on rakkudevaheliste adhesioonivalkude omadused, sealhulgas Ig-sarnased β-võileivad.Paljudel kleepuvatel valkudel (nt kadheriinid, integriinid, adhesiinid ja IZUMO1) on üks või mitu β-sandwich domeeni, mis laiendavad valke rakumembraanilt nende keskkonna sihtmärkideni63, 64, 65.SPACA6 Ig-sarnane domeen sisaldab ka motiivi, mida tavaliselt leidub adhesiooni ja ühtekuuluvuse β-võileibades: paralleelsete ahelate dupletid β-võileibade otstes, mida nimetatakse mehaanilisteks klambriteks66.Arvatakse, et see motiiv suurendab vastupidavust nihkejõududele, mis on väärtuslik rakkudevahelistes interaktsioonides osalevate valkude jaoks.Kuid vaatamata sellele sarnasusele adhesiinidega ei ole praegu tõendeid selle kohta, et SPACA6 interakteerub munavalgetega.SPACA6 ektodomeen ei suuda JUNO-ga seonduda ja SPACA6 ekspresseerivad HEK293T rakud, nagu siin näidatud, peaaegu ei suhtle munarakkudega, millel puudub tsoon32.Kui SPACA6 loob intergameetilisi sidemeid, võivad need interaktsioonid vajada translatsioonijärgseid modifikatsioone või stabiliseerimist teiste sperma valkudega.Viimase hüpoteesi toetuseks seonduvad IZUMO1-puudulikud spermatosoidid ootsüütidega, mis näitab, et sugurakkude adhesioonietapis osalevad ka muud molekulid peale IZUMO127.
Paljudel viirus-, raku- ja arenguga seotud liitvalkudel on omadused, mis ennustavad nende funktsioneerimist fusogeenidena.Näiteks viiruse liitglükoproteiinidel (klassid I, II ja III) on peremeesmembraani sisestatud valgu otsas hüdrofoobne liitpeptiid või silmus.IZUMO143 hüdrofiilsuse kaart ja IST superperekonna struktuur (määratud ja ennustatud) ei näidanud ilmset hüdrofoobset sulandpeptiidi.Seega, kui mõni valk IST superperekonnas toimib fusogeenidena, teevad nad seda teistest tuntud näidetest erineval viisil.
Kokkuvõtteks võib öelda, et sugurakkude sulandumisega seotud valkude IST superperekonna liikmete funktsioonid jäävad ahvatlevaks mõistatuseks.Meie iseloomustatud SPACA6 rekombinantne molekul ja selle lahendatud struktuur annavad ülevaate nende jagatud struktuuride vahelistest suhetest ja nende rollist sugurakkude kinnitumisel ja sulandumisel.
Prognoositavale inimese SPACA6 ektodomeenile vastav DNA järjestus (NCBI registreerimisnumber NP_001303901.1; jäägid 27–246) optimeeriti koodoni järgi ekspressiooniks Drosophila melanogaster S2 rakkudes ja sünteesiti geenifragmendina Kozaki (Eurofins Genomics) kodeeriva järjestusega., BiP sekretsioonisignaal ja vastavad 5' ja 3' otsad selle geeni ligeerimisest sõltumatuks kloonimiseks pMT ekspressioonivektorisse, mis põhineb metallotioneiini promootoril, mida on modifitseeritud selektsiooniks puromütsiiniga (pMT-puro).pMT-puro vektor kodeerib trombiini lõhustamiskohta, millele järgneb 10x-His C-terminaalne märgis (joonis S2).
SPACA6 pMT-puro vektori stabiilne transfektsioon D. melanogaster S2 (Gibco) rakkudesse viidi läbi sarnaselt IZUMO1 ja JUNO43 jaoks kasutatud protokolliga.S2 rakud sulatati ja kasvatati Schneideri söötmes (Gibco), millele oli lisatud lõppkontsentratsiooni 10% (maht/maht) kuumusega inaktiveeritud vasikaloote seerumit (Gibco) ja 1x antimükootilist antibiootikumi (Gibco).Varajase passaaži rakud (3,0 x 106 rakku) plaaditi 6-süvendiliste plaatide (Corning) üksikutesse süvenditesse.Pärast 24-tunnist inkubeerimist 27 °C juures transfekteeriti rakud 2 mg SPACA6 pMT-puro vektori ja Effectene transfektsioonireagendi (Qiagen) seguga vastavalt tootja protokollile.Transfekteeritud rakke inkubeeriti 72 tundi ja seejärel koguti 6 mg/ml puromütsiiniga.Seejärel eraldati rakud täielikust Schneideri söötmest ja pandi seerumivabasse Insect-XPRESS söötmesse (Lonza) valgu suuremahuliseks tootmiseks.1-liitrine partii S2 rakukultuuri kasvatati 8–10 × 106 ml-1 rakkudeks 2-liitrises ventileeritavas lamedapõhjalises polüpropüleenist Erlenmeyeri kolvis, seejärel steriliseeriti lõppkontsentratsiooniga 500 uM CuSO4 (Millipore Sigma) ja filtriti steriilselt.indutseeritud.Indutseeritud kultuure inkubeeriti 27 °C juures 120 pööret minutis neli päeva.
SPACA6 sisaldav konditsioneeritud sööde eraldati tsentrifuugimisega 5660 x g juures 4 °C juures, millele järgnes Centramate tangentsiaalse voolu filtreerimissüsteem (Pall Corp) 10 kDa MWCO membraaniga.Kandke SPACA6 sisaldav kontsentreeritud sööde 2 ml Ni-NTA agaroosvaigu (Qiagen) kolonni.Ni-NTA vaiku pesti 10 kolonni mahu (CV) puhvriga A ja seejärel lisati 1 CV puhvrit A, et saada imidasooli lõppkontsentratsiooniks 50 mM.SPACA6 elueeriti 10 ml puhvriga A, millele oli lisatud imidasooli lõppkontsentratsioonini 500 mM.Restriktsiooniklassi trombiin (Millipore Sigma) lisati otse dialüüsitorusse (MWCO 12-14 kDa) koguses 1 ühik mg SPACA6 kohta vs. 1 l 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 ja 150 mM NaCl (puhver B) dialüüsi jaoks.) temperatuuril 4 °C 48 tundi.Seejärel lahjendati trombiiniga lõhustatud SPACA6 kolm korda, et vähendada soola kontsentratsiooni, ja kanti 1 ml MonoS 5/50 GL katioonivahetuskolonni (Cytiva/GE), mis oli tasakaalustatud 10 mM Tris-HCl-ga, pH 7,5.Katioonivaheti pesti 3 OK 10 mM Tris-HCl-ga, pH 7,5, seejärel elueeriti SPACA6 lineaarse gradiendiga 0 kuni 500 mm NaCl 10 mm Tris-HCl-s, pH 7,5, 25 OK jaoks.Pärast ioonivahetuskromatograafiat kontsentreeriti SPACA6 mahuni 1 ml ja elueeriti isokraatlikult ENrich SEC650 10 x 300 kolonnist (BioRad), mis oli tasakaalustatud puhvriga B. Vastavalt kromatogrammile ühendage SPACA6 sisaldavad fraktsioonid ja kontsentraat.Puhtust kontrolliti Coomassie värvitud elektroforeesiga 16% SDS-polüakrüülamiidgeelil.Valgu kontsentratsiooni kvantifitseeriti neeldumise järgi 280 nm juures, kasutades Beer-Lamberti seadust ja teoreetilist molaarset ekstinktsioonikoefitsienti.
Puhastatud SPACA6 dialüüsiti üleöö 10 mM naatriumfosfaadi (pH 7,4) ja 150 mM NaF vastu ning lahjendati enne CD-spektroskoopia analüüsimist kuni 0,16 mg/ml.Lainepikkusega 185 kuni 260 nm CD-de spektraalne skaneerimine koguti Jasco J-1500 spektropolarimeetriga, kasutades kvartsküvette 1 mm optilise tee pikkusega (Helma) 25 °C juures kiirusega 50 nm/min.CD-spektrid korrigeeriti algtasemel, keskmistati 10 võtet ja teisendati keskmiseks jääk-ellipsisuks (θMRE) kraadides cm2/dmol:
kus MW on iga proovi molekulmass Da;N on aminohapete arv;θ on elliptilisus millikraadides;d vastab optilise tee pikkusele cm;valgu kontsentratsioon ühikutes.