ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplekskeevitatud toru keemiatööstuse keemilise komponendi jaoks, SPECC1L puudulikkus suurendab splaissliigeste stabiilsust ja vähendab kraniaalnärvi harjarakkude eraldumist.

Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Kasutate piiratud CSS-i toega brauseri versiooni.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Lisaks näitame pideva toe tagamiseks saiti ilma stiilide ja JavaScriptita.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 duplekskeevitatud toru keemiatööstusele

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.on juhtiv tootja , kes on spetsialiseerunud roostevabast terasest õmblusteta torudele , lõõmutatud torudele , õmblusteta spiraaltorudele jne .Klientide hõlbustamiseks oleme keevitanud ka torusid.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.omab kõige arenenumaid tootmis- ja katseseadmeid.Saame täielikult rahuldada teie nõuet.Vastavalt väga rangele standardile on meie toodetud torudel alati õige OD ja WT tolerants.Tolerantsi kontroll on rangelt vastavuses standardite tootmisega.Meie tooted on alati klientidega rahul.Meie tooteid ostnud kliendid teenisid rohkem kasumit.
a) OD (välimine läbimõõt): 3,18 mm kuni 101,6 mm
b) WT (seina paksus): 0,5–20 mm
c) Pikkus: vastavalt kliendi soovile
d) Standardid: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 jne
e) Töötlemismeetod: ERW, EFW jne

Liugurid, mis näitavad kolme artiklit slaidi kohta.Kasutage slaidide vahel liikumiseks nuppu Tagasi ja Järgmine või igal slaidil liikumiseks lõpus olevaid slaidijuhtnuppe.
Kraniaalsed närvihari rakud (CNCC) eralduvad embrüonaalsetest närvivoltidest ja migreeruvad neeluvõlvidele, mis moodustavad enamiku keskosa struktuuridest.CNCC düsfunktsioon mängib olulist rolli orofaciaalse lõhe, mis on tavaline kaasasündinud väärareng, etioloogias.Ebatüüpiliste ja sündroomiliste lõhedega patsientidel on leitud heterosügootseid SPECC1L mutatsioone.Siin kirjeldame kanoonilise liimühenduse (AJ) komponentide, β-kateniini ja E-kadheriini täiustatud värvimist kultiveeritud SPECC1L knockdown-rakkudes ning elektronmikrograafid näitavad AJ apikaalset-basaalset difusiooni.SPECC1L rolli mõistmiseks kraniofaciaalses morfogeneesis lõime Specc1l puuduliku hiiremudeli.Homosügootsed mutandid on embrüonaalselt surmavad ja neil on häiritud neuraaltoru sulgemine ja CNCC lamineerimine.AJ valgu värvumine suureneb mutantsetes närvivoltides.See AJ defekt on kooskõlas CNCC delaminatsiooni defektiga, mis nõuab AJ lahustamist.Lisaks on Specc11 mutandid vähendanud PI3K-AKT signaaliülekannet ja suurendanud apoptoosi.In vitro piisas AJ muutuste esilekutsumiseks PI3K-AKT signaaliülekande kergest pärssimisest metsiktüüpi rakkudes.Oluline on see, et SPECC1L koputamise põhjustatud AJ muutusi saab PI3K-AKT raja aktiveerimisega tagasi pöörata.Kokkuvõttes näitavad need andmed, et SPECC1L kui PI3K-AKT signaalimise ja AJ bioloogia uus regulaator on vajalik neuraaltoru sulgemiseks ja CNCC kihistamiseks.
Kraniaalsed närvihari rakud (CNCC-d) lokaliseeruvad dorsaalses neuroektodermis ja eralduvad arenevate närvivoltide neuroepiteelist protsessi kaudu, mis hõlmab epiteeli-mesenhümaalset üleminekut (EMT) 1, 2, 3.Eelmigreeruvad epiteeli CNCC-d häirivad rakkudevahelisi ristmikke ja muutuvad migreeruvateks mesenhümaalseteks CNCC-deks, mis täidavad esimese ja teise neelukaare ning moodustavad suurema osa kraniofatsiaalsest kõhrest.Seega on CNCC funktsiooni reguleerivad geenid sageli häiritud kraniofatsiaalsete kaasasündinud anomaaliate, näiteks orofatsiaalsete lõhede etioloogias, mis mõjutavad kõige sagedamini 1/800 sündi ainuüksi USA-s.Üks kaasasündinud deformatsioone8.
CNCC delaminatsioon langeb kokku eesmise neuraaltoru sulgumisega hiirte embrüonaalse arengu 8,5–9,5 päeva jooksul.Mitmete hiire orofatsiaalsete lõhedega seotud geenide mutantidel on ka teatud tüüpi neuraaltoru defektid, sealhulgas Irf69, 10, Ghrl310, Cfl111 ja Pdgfrα12.Neuraaltoru sulgemise ja CNCC kihistumise protsesse võib siiski pidada sõltumatuks, kuna Splotch mutantsel hiirel (Pax3) on närvitoru sulgemise defektid, ilma et see mõjutaks CNCC kihistumist või migratsiooni 13, 14.Täiendavad hiiremudelid, millel on CNCC dissektsiooni ja neuraaltoru sulgemise defektid, aitavad piiritleda nende kahe protsessi ühist molekulaarset alust.
CNCC eraldamine neuroepiteelirakkudest nõuab adhesiivsete ristmike (AJ) lahustamist, mis koosnevad valgukompleksidest, mis sisaldavad muu hulgas aktiini filamentidega seotud E-kadheriini, β-kateniini, α-E-kateniini ja α-aktiniini 2 Üleekspressiooni uuringud E-kadheriin närvivoltides näitasid CNCC delaminatsiooni vähenemist või viivitust.Vastupidi, E-kadheriini pärssimine põhjustab varajase kihistumise 15, 16.Paljud tegurid, mis vahendavad EMT-d CNCC kihistumise ajal, on transkriptsioonifaktorid (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ja ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) remodelleerivad valgud, nagu maatriksi metalloproteinaasid (MMP), kuid CNCC-d on otsesed tsütoskeleti AJ regulaatorid. pole veel teada.On teada, et PI3K-AKT rada antagoniseerib E-kadheriini taset, peamiselt vähiuuringutest17.Hiljutised uuringud on näidanud, et PDGFα-põhise PI3K-AKT signaaliülekande kadumine hiirtel põhjustab kraniofaciaalseid kõrvalekaldeid, sealhulgas suulaelõhe ja neuraaltoru defekte12.Kuid seos PI3K-AKT raja ja AJ stabiilsuse vahel CNCC kihistumisel on ebaselge.
Varem tuvastasime SPECC1L esimese mutantse geenina kahel inimesel, kellel on suust silma ulatuv tõsine lõhe, mida nimetatakse kaldus lõheks (ObFC) või Tessier IV18 lõheks.SPECC1L mutatsioonid on tuvastatud kahes mitme põlvkonna perekonnas, kellel oli autosomaalselt domineeriv Opitz G/BBB sündroom (OMIM #145410), kus haigetel inimestel esines hüperdistants ja huule-/suulaelõhe19, ning ühes perekonnas, kellel oli sääreluu üledistantsi sündroom (OMIM #145420)20. .enam kui pooled Opitz G/BBB sündroomi juhtudest on X-seotud (OMIM #300000) ja on põhjustatud mutatsioonidest MID1 geenis, mis kodeerib mikrotuubulitega seotud rakuskeleti valku 22.Me oletame, et SPECC1L, samuti mikrotuubulite ja aktiini tsütoskeletiga seotud valk, võib vahendada signaaliülekannet, mis on vajalik aktiini tsütoskeleti remodelleerumiseks raku adhesiooni ja migratsiooni ajal 18 .In vitro ja in vivo uuringute kaudu kirjeldame nüüd SPECC1L-i kui uudset AJ stabiilsuse regulaatorit PI3K-AKT signaalimise kaudu.Rakutasandil põhjustas SPECC1L puudulikkus pan-AKT valgu taseme languse ja AJ apikaalse-basaalse dispersiooni suurenemise, mis elimineeriti AKT raja keemilise aktiveerimisega.In vivo on Specc11 puudulikkusega embrüotel kahjustatud neuraaltoru sulgumine ja vähenenud CNCC dissektsioon.Seega toimib SPECC1L kõrgelt reguleeritud raku adhesioonil põhinevas signaaliülekandes, mis on vajalik normaalseks CNCC funktsiooniks näo morfogeneesi ajal.
SPECC1L rolli iseloomustamiseks rakutasandil kasutasime eelnevalt kirjeldatud stabiilset osteosarkoomi rakuliini U2OS, mis oli SPECC1L18-s puudulik.Nendel stabiilsetel SPECC1L (kd) knockdowniga U2OS-rakkudel oli SPECC1L transkriptide ja valkude taseme mõõdukas (60–70%) langus koos migratsiooni ja aktiini tsütoskeleti 18 ümberkorraldamise defektidega. Seevastu tõsine mööduv langus On näidatud, et SPECC1L põhjustab mitootilisi defekte 23 .Täiendaval iseloomustamisel leidsime, et meie stabiilsed SPECC1L-kd rakud muutsid morfoloogiat väga kõrgel konfluentsusastmel (joonis 1).Üksikud kontrollrakud ja madala konfluentsusega kd-rakud nägid välja sarnased (joonis 1A, D).24 tundi pärast liitmist säilitasid kontrollrakud oma risttahuka kuju (joonis 1B, E), samas kui SPECC1L-kd rakud pikenesid (joonis 1C, F).Selle rakukuju muutuse ulatus fikseeriti kontrollrakkude ja kd-rakkude in vivo reaalajas pildistamisel (film 1).SPECC1L rolli määramiseks konfluentsetes rakkudes uurisime kõigepealt selle ekspressiooni.Leidsime, et SPECC1L valgu tase tõusis liitmisel (joonis 1G), samas kui SPECC1L transkripti tasemed ei suurenenud (joonis 1H).Lisaks kogunes rakutiheduse suurenedes SPECC1L valk rakkudevahelistel piiridel (joonis 2A-E), mille muster kattub membraaniga seotud β-kateniini omaga (joonis 2A'-E').Arvestades SPECC1L seost aktiini tsütoskeletiga 18, 23, oletasime, et SPECC1L interakteerub aktiinipõhiste liimühendustega (AJ).
(AF) SPECC1L knockdowni (DF) rakud pikenevad kõrgel liitumisel (F) võrreldes kontroll-U2OS-rakkudega (AC).Siin on näidatud kolm kuuest ajapunktist (T1, T3, T6), mille valisime erinevate rakutiheduste jaoks.(G) Western blot analüüs, mis näitab, et SPECC1L valk stabiliseerub kõrgel konfluentsusastmel võrreldes kontrollrakkude madala konfluentsusastmega.SPECC1L Western blot näitab eeldatavat 120 kDa riba ja suurema molekulmassiga riba, mis võib olla translatsioonijärgselt modifitseeritud (*).Western blot analüüs viidi läbi samadel tingimustel madala ja kõrge konfluentsuse jaoks.Samast blotist võeti pildid, mis näitavad SPECC1L-i madalal ja kõrgel liitumisel.Sama blot eemaldati ja uuriti uuesti β-aktiini antikehaga.(H) Kvantitatiivne RT-PCR analüüs ei näidanud olulisi muutusi SPECC1L transkripti tasemetes.Vearibad tähistavad nelja sõltumatu katse SEM-e.
(AE) Valisime kuus ajapunkti (T1-T6), mis esindavad rakkude tihedust, et normaliseerida raku kuju analüüsi ja AJ muutusi U2OS rakkudes SPECC1L knockdowniga (kd).Esimesed viis neist ajapunktidest hõlmasid üksikuid rakke (T1), väikeste rakuklastrite (T2) 50–70% liitmist, sulandumist ilma kd-rakkude ümberkujundamiseta (T3), kd-rakkude ümberkujundamist (T4) ja 24-tunniseid muutusi.kd (T5) rakkude tagumises vormis.SPECC1L valk hajus valdavalt tsütoplasmas T1 (A), kuid selle akumuleerumist täheldati rakkudevahelistel piiridel järgmistel ajahetkedel (B – E, nooled).(FJ) β-kateniinil on sarnane akumulatsioon AJ kompleksiga seotud rakkudevahelistel piiridel.(A'-E') SPECC1L ja β-kateniin näitavad rakkude piiridel kattuvat värvimist suure rakutihedusega (nooled).(F'-J') SPECC1L-kd rakkudes näib β-kateniini värvumine madala rakutiheduse (F'-H') korral normaalne, kuid laieneb raku kuju muutudes (I', J'; nooled), mis näitab, et AJ on muutunud.Vardad = 10 µm.
Seejärel proovisime määrata SPECC1L puudulikkuse mõju AJ-le.Kasutasime mitmeid AJ-ga seotud markereid, sealhulgas kanoonilisi komponente F-aktiin, müosiin IIb, β-kateniin ja E-kadheriin 24, 25, 26, 27.Aktiini stressi kiud suurenesid SPECC1L-kd rakkudes, nagu eelnevalt kirjeldatud (joonised 3A, B)18.Aktiinfilamentidega seotud müosiin IIb näitas SPECC1L-kd rakkude arvu sarnast suurenemist in vitro (joonised 3C, D).AJ-ga seotud β-kateniin seondub kadheriiniga rakumembraanil, näidates normaalset "kärje" ekspressioonimustrit kontrollkubotsüütides (joonis 3E, G).Huvitav on see, et konfokaalset mikroskoopiat kasutavatel lamedate piltide puhul näitas β-kateniini (joonis 3E, F) ja E-kadheriini (joonis 3G, H) värvimine konfluentse SPECC1L-puudulike rakkude rakumembraanil silmatorkavaid pikendatud värvimise mustreid.See AJ-ga seotud β-kateniini värvumise laienemine kd-rakkudes oli kõige märgatavam liitumisel, kuid näis olevat enne raku kuju muutumist (joonis 2F-J, F'-J').Selle laiendatud AJ värvimise füüsikalise olemuse kindlakstegemiseks uurisime SPECC1L-kd U2OS rakkude apikaalse basaalpinna rakupiire transmissioonielektronmikroskoopia (TEM) abil (joonis 3I, J).Erinevalt kontrollrakkudest (joonis 3I), millel olid eraldi elektrontihedad piirkonnad, mis viitasid AJ-le (nooled), näitasid kd-rakud (joonis 3J) piki apikobasaaltasandit suuri, külgnevaid kõrge elektrontihedusega piirkondi, mis viitavad AJ-le..Lisaks, põiki lõikudes, täheldasime ulatuslikke rakumembraani voldid kd rakkudes (joonis S1A, B), mis selgitab β-kateniini ja E-kadheriini värvimisribade laiendatud mustrit (joonis 3F, H).SPECC1L-i rolli toetamiseks AJ-des sadestati β-kateniin koos SPECC1L-iga konfluentse U2OS-rakkude lüsaatides (joonis 3K).Koos AJ-markerite laiendatud immunovärvimisega oli TEM-analüüs kooskõlas meie hüpoteesiga, et SPECC1L puudulikkus suurendab AJ apikaalset-basaalset tihedust ja dispersiooni.
(AH) Suurenenud F-aktiini värvumine kd-rakkudes 48 tundi pärast liitmist (T6; A, B).F-aktiiniga (C, D) seotud müosiini IIb muutunud värvumine.β-kateniini ja E-kadheriini membraani värvimise sujuv muster kontrollrakkudes (E, G) paranes SPECC1L-kd (F, H) rakkudes.Vardad = 10 µm.(I–J) Elektronmikrograafid, mis jälgivad apikaalset-basaalset rakkudevahelist ristmikku.Kontrollrakkudel on erinevad elektrontihedad piirkonnad, mis näitavad kleepuvaid ristmikke (I, nooled).Seevastu kogu SPECC1L-kd rakkude apikaalne-basaalne ristmik paistis elektrontihedana (J, nooled), mis näitab kleepuvate ühenduste suurenenud tihedust ja hajumist.(K) β-kateniin kaasimmunosadestati SPECC1L-ga konfluentsetes U2OS rakulüsaatides.Pilt on tehtud ühest kohast, mis esindab ühte neljast sõltumatust katsest.
SPECC1L rolli mõistmiseks kraniofatsiaalses morfogeneesis lõime Specc1l puuduliku hiiremudeli, kasutades kahte sõltumatut ES trap rakuliini, DTM096 ja RRH048 (BayGenomics, CA), mis esindavad introni 1 ja Specc1l transkriptid püüti 15 juures (joonis 1). .4A, joonis S2).Peibutusvektori sisestamise genoomne asukoht määrati kogu genoomi järjestamisega ja kinnitas PCR (joonis S2).Mõlemad geenilõksu kujundused võimaldasid püüdmisel ka Specc11-lacZ reporterite kaadrisisese liitmise.Seetõttu kasutati Spec11 ekspressiooni indikaatorina X-gal värvimisega määratud lacZ ekspressiooni.Mõlemad alleelid näitasid sarnaseid lacZ ekspressioonimustreid, kusjuures DTM096 geenilõks intronis 1 näitas tugevamat ekspressiooni kui RRH048 intronis 15 (pole näidatud).Specc1l on aga laialdaselt ekspresseeritud, eriti tugeva ekspressiooniga närvivoltides E8.5 (joonis 4B), neuraaltorus ja näoprotsessides E9.5 ja E10.5 (joonis 4C, D) ning arenevates jäsemetes. E10 juures.5 ja silmad (joonis 4D).Varem teatasime, et SPECC1L ekspressioon esimeses neelukaares E10.5 juures esines epiteelis ja selle aluseks olevas mesenhüümis18, mis on kooskõlas CNCC liiniga.SPECC1L ekspressiooni testimiseks CNCC-s teostasime E8.5 närvivoldid (joonis 4E-J) ja E9.5 koljulõigud (joonis 4K-).E8.5 juures värvis SPECC1L intensiivselt närvivolte (joonis 4E, H), sealhulgas NCC-markeritega värvitud rakke (joonis 4G, J).E9.5 juures värvus SPECC1L (joonis 4K, N) tugevalt migreeruv CNCC, mis värvus koos AP2A (joonis 4L, M) või SOX10 (joonis 4O, P).
(A) Hiire Specc11 geeni skemaatiline esitus, mis näitab peibutusvektori sisestamist ES DTM096 (intron 1) ja RRH048 (intron 15) rakukloonidesse.Heterosügootsete Specc1lDTM096 embrüote (BD) lacZ-värvimine, mis esindavad Specc1l ekspressiooni vahemikus E8.5 kuni E10.5.NE = neuroektoderm, NF = närvivolt, PA1 = esimene neeluvõlv.(EP) SPECC1L immunovärvimine NCC markeritega AP2A ja SOX10 E8.5 (NF; EJ) närvivoltides ja E9.5 (KP) koljuosades.SPECC1L värvimist täheldati laialdaselt närvivoltides E8.5 (E, H; nooleotsad), sealhulgas rakkudes, mis olid märgistatud AP2A (F, G; nooleotsad) ja SOX10 (I, J; nooleotsad).E9.5 juures värvis SPECC1L tugevalt migreeruvaid CNCC-sid (K, N; nooled), mis olid märgistatud AP2A (L, M; nooled) ja SOX10 (O, P; nooled).
Heterosügootsete Specc1lDTM096/+ ja Specc1lRRH048/+ hiirte ristumine näitab, et kaks geenilõksu alleeli ei ole komplementaarsed ning et kummagi geenilõksu alleeli ühendi heterosügootid ja embrüonaalsed homosügootid on embrüonaalselt surmavad (tabel S1).Mendeli suhtarvud näitasid heterosügootide elulemuse vähenemist sündides (eeldatavalt 1,34 vs 2,0).Märkisime heterosügootide seas madalat perinataalset suremust, mõnel oli kraniofacial anomaaliaid (joonis S3).Nende perinataalsete kraniofatsiaalsete fenotüüpide vähene läbitungimine muudab aga nende aluseks olevate patofüsioloogiliste mehhanismide uurimise keeruliseks.Seetõttu keskendusime homosügootsete Specc11 mutantide embrüonaalsele surmavale fenotüübile.
Enamik heterosügootseid või homosügootseid Specc1lDTM096/RRH048 mutantseid embrüoid ei arenenud pärast E9.5–10.5 (joonised 5A–D) ja neuraaltoru ei sulgunud ees (joonised 5B, D) ja mõnikord sulgus tagant (pole näidatud) ..Seda kraniaalse neuraaltoru sulgumise defekti seostati enamiku CNCC-ga, millel oli DLX2, jäämine neuraalvoltidesse E10.5 juures, mis näitab, et dissektsioon puudub (joonis 5A'-D').Et teha kindlaks, kas CNCC üldine suurus on samuti vähenenud, märgistasime CNCC read GFP-ga meie geenilõksuliinides Wnt1-Cre ja ROSAmTmG-ga.Voogedastame sorteeritud GFP+ NCC ja GFP- (RFP+) mitte-NCC tervetest embrüotest.E9.5 juures ei muutunud voolu järgi sorteeritud GFP-märgistatud CNCC-de osakaal WT ja mutantsete embrüote vahel (pole näidatud), mis näitab normaalset CNCC spetsifikatsiooni.Seetõttu oletasime, et Wnt1-Cre ja DLX2 jääkvärvimine avatud närvivoltides (joonis 5B') oli tingitud defektsest CNCC kihilisusest, mis võib olla tingitud AJ-rakkude suurenenud tihedusest või dispersioonist, nagu on näha SPECC1L-kd rakkudes.CNCC olemasolu kinnitamiseks närvivoldis kasutasime NCC markereid SOX10, AP2A ja DLX2 (joonis 5E-R).E8.5 juures täheldati WT (joonis 5E, G, I) ja Specc1l mutandi (joonis 5F, H, J) lõikudes närvivoltide värvumist kõigi kolme NCC-markeri puhul.Kell E9.5, kui NCC markerid värvisid migreeruvat NCC-d WT sektsioonides (joonis 5M, O, Q), täheldati NCC jääkvärvimist Specc1l mutantsete embrüote paljastatud närvivoltides (joonis 5N, P, R).Kuna SOX10 ja DLX2 tähistavad migreeruvaid CNCC-sid, viitab see tulemus sellele, et SPECC1L-puudulikud CNCC-d saavutavad migratsioonijärgse spetsifikatsiooni, kuid ei suuda migreeruda närvivoltidest.
Specc11 puudulikkus põhjustab defektset neuraaltoru sulgumist, kraniaalsete närviharjade rakkude delaminatsiooni ja AJ-sid.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrüo, mis kannab migreeruvaid kraniaalseid närvirakke (CNCC), mis on märgistatud Wnt1-Cre-ga (A').Seevastu Specc11 mutantsetel embrüotel on avatud närvivoldid (B), noolepead ja CNCC-d, mis pole migreerunud (B', nooleotsad).(C, D') E10.5 WT embrüote (C, C') ja Specc1l (D, D') CNCC markeri DLX2 ereda väljaga kujutised (C, D') ja immunovärvimine (C', D').WT E10.5 embrüote puhul koloniseerib DLX2-positiivne CNCC lõpusekaared (C', nooled), samas kui mutantidel püsib silmatorkav värvumine avatud närvivoltides (D', nooled) ja esimestes neelukaartes (D', nooled).) mõne värvimisega (nooled), mis näitavad CNCC halba delaminatsiooni ja migratsiooni.ER) WT ja Specc1l mutantsete embrüote lõigud etapis E8.5 (E–L) ja E9.5 (M–R) märgistati NCC markeritega SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) ja DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 juures täheldati NCC värvimist metsiktüüpi närvivoldi (NF) ja mutantsetes lõikudes.SOX10 ja β-kateniini koosvärvimine E8.5 WT-s (K) ja mutandis (L) näitas suurenenud β-kateniini värvumist närvivoltide rakupiiridel.E9.5 juures täheldati rändavate CNCC-de (M, O, Q) metsiktüüpi värvumist, mutantide puhul aga värvisid kihistamata CNCC-d avatud närvivolte (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ märgistamise analüüs E9.5 mutatsiooniga WT ja Specc11DTM096/RRH048 embrüote koronaalsektsioonides.Ligikaudne lõiketasapind on näidatud paremas ülanurgas.Mutantsete kudede lõikudes täheldati F-aktiini (S, T) ja müosiini IIb (U, V) suurenenud värvumist.Sarnaselt joonisel 3 toodud in vitro tulemustele täheldati mutantsetes embrüodes β-kateniini (W, X) ja E-kadheriini (Y, Z) membraani värvumist.(AA-BB) Metsiktüüpi embrüo lõigu elektronmikrograaf, mis vaatab üle apikaalse basaalraku piiri, näitab selget elektrontihedat piirkonda, mis viitab kleepuvatele ristmikele (AA, nooled).Seevastu Specc11 mutantsete embrüote osades (BB, nooled) on kogu apikobasaalne ristmik elektrontihe, mis näitab liimiühenduste suurenenud tihedust ja hajutamist.
Et testida meie hüpoteesi, et vähenenud kihilisus on tingitud muutunud AJ-st, uurisime AJ märgistamist Specc1l mutantsete embrüote paljastatud närvivoltides (joonis 5S-Z).Täheldasime aktiini stressi kiudude suurenemist (joonis 5S, T) ja sellega kaasnevat müosiini IIB värvumise lokaliseerumist aktiinikiududel (joonis 5U, V).Oluline on see, et rakkudevahelistel piiridel täheldasime β-kateniini (joonis 5W, X) ja E-kadheriini (joonis 5Y, Z) värvumise suurenemist.Uurisime ka NCC β-kateniini värvimist E8.5 embrüote närvivoltides (joonis 5K, L).β-kateniini värvumine näis olevat tugevam Specc1l mutantsete närvivoltide korral (joonis 5L ja K), mis viitab sellele, et AJ muutused olid alanud.E9.5 embrüote koljuosade elektronmikrograafidel täheldasime jällegi suurenenud difuusset elektrontihedat värvimist Specc1l mutantsetes embrüodes võrreldes WT-ga (joonis 5AA, BB ja S1E-H).Kokkuvõttes toetavad need tulemused meie in vitro tulemusi SPECC1L-kd U2OS rakkudes ja viitavad sellele, et meie mutantsete embrüote CNCC kihistumisele eelneb kõrvalekalduv AJ värvimine.
Arvestades teadaolevat antagonistlikku seost AKT aktiivsuse ja E-kadheriini stabiilsuse vahel, 17, 28 püstitasime hüpoteesi PI3K-AKT signaalimise kaasamise kohta.Lisaks täheldasime mõnedes meie mutantsetes embrüodes subepidermaalset villide teket, mis pääsesid letaalsusest (<5%) E9,5–10,5 ja asusid selle asemel umbes E13,5 (joonis S3).Subepidermaalsed vesiikulid on PDGFRα12-l põhineva vähenenud PI3K-AKT signaaliülekande tunnuseks.Fantauzzo jt.(2014) teatasid, et PDGFRα-põhise PI3K aktiveerimise katkestamine PdgfraPI3K/PI3K mutantsetes embrüodes põhjustab subepidermaalseid vesiikuleid, neuraaltoru defekte ja suulaelõhe fenotüüpe.Tõepoolest, pan-AKT ja aktiivse fosforüülitud Ser473-AKT tasemed vähenesid in vivo Specc1l mutantsetes kudedes kuni E9.5 embrüonaalse seiskumiseni (joonis 6A-D).Fosforüülitud Ser473-AKT taseme langus võib olla täielikult tingitud pan-AKT tasemete vähenemisest in vivo (joonis 6E) ja in vitro (joonis 6F).In vitro langust täheldati ainult siis, kui U2OS-rakud olid tugevalt konfluentsed raku kuju ja AJ tiheduse muutustega (joonis 6D).Seega näitavad meie andmed, et SPECC1L on PI3K-AKT signaaliülekande uus positiivne regulaator kraniofaciaalses morfogeneesis.
(A–E) E8.5 (A,B) ja E9.5 (C,D) koljulõigud või E9.5 lüsaadid Specc1l mutantsetest embrüotest (E), mis näitavad aktiivse fosforüülitud S473-AKT ja pan-AKT valgu vähenemist , võrreldes kontroll-WT-ga.Western blotting viidi läbi metsiktüüpi lüsaatide ja mutantsete lüsaatidega samadel tingimustel.SPECC1L jaoks näidatud pildid võeti ühest blotist.Sama blot eemaldati ja uuriti uuesti pan-ACT- ja β-aktiinivastaste antikehadega.Pan-AKT tase E8.5 närvivoltides (A, B) ja fosforüülitud S473-AKT tase E9.5 koljuosades vähenes oluliselt.( F ) Pan-AKT tasemed vähenesid sarnaselt SPECC1L-kd U2OS rakkude lüsaatides, mis koguti suurel liitumisel.Vearibad tähistavad SEM-e kolmest sõltumatust Western blot kvantifitseerimisest.(GJ) WT embrüote lõigud E9.5 juures, mis on värvitud vastavalt KI67 ja lõhustatud kaspaasiga 3, mis näitavad rakkude proliferatsiooni (G, G') ja vähest apoptootilist aktiivsust (H, H').Specc11 mutantsed embrüod näitavad võrreldavat rakkude proliferatsiooni (I), kuid apoptoosi läbivate rakkude arv on oluliselt suurenenud (J).
Seejärel uurisime proliferatsiooni ja apoptoosi markereid.Me ei täheldanud mingeid erinevusi E9.5 embrüote proliferatsioonis (joonis 6E, G võrreldes I-ga), kusjuures proliferatsiooniindeks oli 82,5% WT mutantide ja 86,5% Specc1l mutantide puhul, mõõdetuna KI67 värvimisega (p <0,56, Fisheri tõbi). täpne test).Samamoodi ei täheldanud me mingeid erinevusi apoptoosis, mida mõõdeti lõhustatud kaspaas 3 värvimisega neuraalsetes voldikutes E8.5 juures kuni embrüo seiskumiseni (pole näidatud) (pole näidatud).Seevastu apoptoos suurenes oluliselt kõigis E9.5 mutantsetes embrüodes (joonis 6F, H ja J).See üldine apoptoosi suurenemine on kooskõlas vähenenud PI3K-AKT signaaliülekande ja varajase embrüonaalse letaalsusega 29, 30, 31.
Järgmiseks, et kinnitada PI3K-AKT signaaliülekande põhjuslikku rolli meie kd rakkude AJ muutustes, muutsime keemiliselt rada kontroll- ja kd rakkudes (joonis 7A-F).Markerina kasutasime konfluentsetes SPECC1L-kd rakkudes täheldatud rakukuju muutuse fenotüüpi, mille kvantifitseerisime, kasutades pikima mõõtme (pikkuse) ja vastava vertikaalse mõõtme (laiuse) suhet.Suhteliselt ümmarguste või risttahukakujuliste rakkude puhul eeldatakse suhet 1 (joonis 7G).Lisaks rakukujule kinnitasime ka β-kateniini värvimise mõju AJ-le (joonis 7A'-F').PI3K-AKT raja inhibeerimine wortmanniini abil oli piisav, et muuta raku kuju kontrollrakkudes (joonis 7A, C) ja AJ (joonis 7A').PI3K-AKT aktivaator SC-79 ei mõjutanud raku kuju (joonis 7A, E) ega AJ laienemist (joonis 7A') kontrollrakkudes.SPECC1L-kd rakkudes põhjustas PI3K-AKT raja edasine allasurumine suurenenud apoptoosi (joonis 7B, D) ja β-kateniini värvumise märgatava suurenemise (joonis 7B'), mis on kooskõlas meie in vivo raskete mutantidega.Oluline on see, et PI3K-AKT raja aktiveerimine parandas oluliselt raku kuju (joonis 7B, F) ja AJ fenotüüpe (joonis 7B).Rakkude kuju muutused kvantifitseeriti rakkude ümarussuhtena (CCR) ja võrreldi olulisuse suhtes, nagu ülalpool kirjeldatud (joonis 7G).Tõepoolest, kontrollrakkudes (joonis 7G, ​​CCR = 1,56) piisas ravi wortmanniiniga, et oluliselt muuta raku kuju (joonis fig 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) samasugusel määral kui täheldati. SPECC1L-s.-kd rakud (joonis 7G, ​​CCR = 3,46).SPECC1L-kd rakkude töötlemine wortmanniiniga (joonis 7G, ​​CCR = 3,60, tühine) ei olnud olulisem kui töötlemata kd-rakud (joonis 7G, ​​CCR = 3,46, tühine) või wortmanniiniga töödeldud kontrollrakud (joonis 7G)., CCR = 3,46, tühine) mõjutab lisaks rakkude pikenemist (7G, CCR = 3,61, tühine).Kõige tähtsam on see, et SC-79 AKT aktivaator taastas SPECC1L-kd rakkude pikliku fenotüübi (joonis 7G, ​​CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Need tulemused kinnitavad, et SPECC1L reguleerib PI3K-AKT signaaliülekannet ja viitab sellele, et SPECC1L mõõdukas langus mõjutab rakkude adhesiooni, samas kui tugev langus põhjustab apoptoosi (joonis 8).
(A–F') kontroll- (A, C, E) ja SPECC1L-kd (B, D, F) rakud, mida on töödeldud PI3K-AKT raja inhibiitori wortmanniini (C, D) või SC-79 aktivaatoriga (E, F) Ravi Töötlemata kontrollrakud on risttahukakujulised (A) normaalse β-kassi rakuvärvimisega (A'), samas kui kd-rakud on piklikud (B) suurenenud β-kassi värvumisega (B').Pärast PI3K-AKT raja allasurumist pikenesid kontrollrakud (C) β-kassi laienemisega (C'), samal ajal kui kd-rakud hakkasid läbima apoptoosi (D), mis on sarnane meie väga muteerunud embrüotega ja millel on äärmiselt tugevnenud β-kass.värvimine (D').Pärast PI3K-AKT raja aktiveerimist jäid kontrollrakud risttahukakujuliseks (E) ja neil oli normaalne β-cat (E') värvumine, samas kui kd rakkudel oli oluliselt paranenud raku kuju (F) ja β-cat (F') värvumine, mis näitab, et (G) Raku kuju muutuse aste (AF) kvantifitseeriti, kasutades pikima mõõtme (pikkus) ja vastava vertikaalse mõõtme (laius) raku ümarussuhet (CCR), kasutades tarkvara MetaMorph.Töötlemata (NT) SPECC1L-kd rakud (CCR = 3,46) olid oluliselt pikemad kui kontrollrakud (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Worti PI3K-AKT raja inhibeerimine kontrollrakkudes oli piisav, et tekitada raku kuju sarnane pikenemine (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Samamoodi taastas AKT aktiveerimine SC-79 poolt SPECC1L-kd rakkudes rakkude pikenemise kontrolltasemele (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).SPECC1L-kd rakkude töötlemine wortmanniiniga suurendas apoptoosi, kuid ei suurendanud raku kuju muutust (CCR=3,60) võrreldes töötlemata kd-ga (CCR=3,46, ns) või wortmanniiniga töödeldud kontrollrakkudega (3,61), mida täheldati aastal.ns = pole oluline.Näidatud on +/- SEM mõõtmised 50 raku kohta.Statistilised erinevused arvutati Studenti t-testi abil.
(A) PI3K-AKT raja inhibeerimise ja aktiveerimise skemaatiline esitus, mille tulemuseks on vastavalt AJ muutused ja päästmine.(B) Pakutud mudel AKT valgu stabiliseerimiseks SPECC1L abil.
Premigratiivsed CNCC-d nõuavad AJ lüüsi, et eralduda eesmisest närvivoldi neuroepiteelirakkudest 1, 15, 32.AJ komponentide suurenenud värvumine ja apikaalse-basaalse AJ asümmeetrilise jaotuse kadumine SPECC1L-puudulikes rakkudes nii in vitro kui ka in vivo koos SPECC1L füüsilise lähedusega β-kateniinile viitavad sellele, et SPECC1L toimib AJ lokaalse stabiilsuse nõuetekohaseks säilitamiseks. organisatsiooni lihased.aktiini tsütoskelett.SPECC1L seos aktiini tsütoskeleti ja β-kateniiniga ning kondenseerunud aktiini filamentide arvu suurenemine SPECC1L puudumisel on kooskõlas AJ tiheduse täheldatud suurenemisega.Teine võimalus on see, et suurenenud aktiinikiudude arv SPECC1L-puudulikes rakkudes põhjustab rakkudevahelise pinge muutumist.Kuna raku stress mõjutab AJ 33 dünaamikat, võivad pinge muutused põhjustada hajusamat AJ 34 .Seega mõjutavad kõik muudatused CNCC kihte.
Wnt1 ekspresseeritakse varajastes närvivoltides, mis põhjustavad närviharja rakke.Seega märgib Wnt1-cre liini jälgimine nii eel- kui ka migreeruvat NCC35.Kuid Wnt1 tähistab ka seljaajukoe kloone, mis on samuti tuletatud varastest närvivoltidest 35, 36 , mistõttu on tõenäoline, et meie E9.5 mutantide värvimine Wnt1 markerite jaoks avatud närvivoltides ei ole CNCC.Meie positiivne värvimine NCC-markerite AP2A ja SOX10 jaoks kinnitas, et Specc11 mutantsete embrüote paljastatud närvivoldid sisaldasid tõepoolest CNCC-d.Lisaks, kuna AP2A ja SOX10 on varajase migratsiooni NCC markerid, näitas positiivne värvimine, et need rakud on migratsioonijärgsed CNCC-d, mida ei saa E9.5 abil stratifitseerida.
Meie andmed viitavad sellele, et AJ molekulaarset reguleerimist SPECC1L poolt vahendab PI3K-AKT signaalimine.AKT signaaliülekanne on vähenenud SPECC1L puudulikes rakkudes ja kudedes.Fantauzzo jt leiud.toetavad PI3K-AKT signaaliülekande otsest rolli kraniofaciaalses morfogeneesis.(2014) näitas, et PDGFRα-põhise PI3K-AKT signaaliülekande aktiveerimise puudumine põhjustab suulaelõhe fenotüübi.Samuti näitame, et PI3K-AKT raja inhibeerimine on piisav AJ ja raku kuju muutmiseks U2OS rakkudes.Kooskõlas meie leidudega, Cain et al.37 näitas, et PI3K α110 subühiku allareguleerimine endoteelirakkudes põhjustab samalaadset peritsellulaarse β-kateniini värvumise suurenemist, mida nimetatakse "ühenduvusindeksi" suurenemiseks.Kuid endoteelirakkudes, mille aktiini filamendid on juba väga organiseeritud, põhjustab PI3K-AKT raja pärssimine lahtise raku kuju.Seevastu SPECC1L-kd U2OS rakkudel oli piklik raku kuju.See erinevus võib olla rakutüübispetsiifiline.Kui PI3K-AKT signaaliülekande pärssimine mõjutab püsivalt aktiini tsütoskeletti, siis mõju raku kujule määravad pinge muutused, mis on põhjustatud muutustest tsentraalsete aktiinikiudude tiheduses ja organisatsioonis.U2OS-i rakkudes kasutasime SPECC1L-puuduliku AJ muutuse ja taastumise markerina ainult raku kuju muutusi.Kokkuvõtteks oletame, et AKT raja pärssimine SPECC1L puudulikkuse korral suurendab AJ stabiilsust ja vähendab delaminatsiooni CNCC-s.
Huvitaval kombel vähenesid pan-AKT tasemed in vitro ja in vivo lisaks fosforüülitud 473-AKT tasemetele SPECC1L puudumisel, mis viitab PI3K-AKT signaaliülekande reguleerimisele AKT valgu stabiilsuse või käibe tasemel.SPECC1L ja MID1 geenid, mis mõlemad on seotud Opitz/GBBB sündroomiga, kodeerivad valke, mis stabiliseerivad mikrotuubuleid 18, 22 .Mehhanism, mille abil SPECC1L ja MID1 vahendavad mikrotuubulite stabiliseerimist, ei ole täielikult teada.SPECC1L puhul hõlmab see stabiliseerimine mikrotuubulite alamhulga täiustatud atsetüülimist18.Võimalik, et SPECC1L kasutab sarnast mehhanismi teiste valkude, näiteks AKT, stabiliseerimiseks.On näidatud, et lüsiinijääkide atsetüülimine AKT-valgus viib membraani lokaliseerimise ja fosforüülimise vähenemiseni38.Lisaks on selle membraani lokaliseerimiseks ja aktiveerimiseks vajalik K63 ahela ubikvitineerimine sama lüsiinijäägi juures AKT-s 39, 40.Mitmetest SPECC1L valkudega interakteeruvatest teguritest, mis on tuvastatud erinevates suure läbilaskevõimega pärmi kahehübriidsetes ekraanides, on neli – CCDC841, ECM2942, APC ja UBE2I43 – seotud valgu käibe või stabiilsusega ubikvitineerimise või sumoüülimise kaudu.SPECC1L võib olla seotud AKT lüsiinijääkide translatsioonijärgse modifikatsiooniga, mõjutades AKT stabiilsust.SPECC1L kriitiline roll AKT valgu lokaliseerimisel ja stabiilsuses tuleb siiski veel välja selgitada.
SPECC1L ekspressiooni tõsised defektid in vivo põhjustasid suurenenud AJ-markerite värvumise ja defektse CNCC-katte, samuti suurenenud apoptoosi ja varajast embrüonaalset letaalsust.Varasemad aruanded on näidanud, et suurenenud apoptoositasemega hiire mutandid on seotud neuraaltoru defektidega 44, 45, 46, 47 ja kraniofaciaalsete defektidega .On oletatud, et ülemäärane rakusurm närvivoltides või neelukaartes võib põhjustada ebapiisava morfogeneetilise liikumise jaoks vajalike rakkude arvu 48, 49, 50.Seevastu meie SPECC1L-puudulikud rakuliinid, mille SPECC1L ekspressioon oli mõõdukalt vähenenud, näitasid ainult AJ muutusi ilma suurenenud rakusurma tõenditeta.Kuid PI3K-AKT raja keemiline inhibeerimine nendes Kd rakkudes suurendas apoptoosi.Seega tagab SPECC1L ekspressiooni või funktsiooni mõõdukas langus rakkude ellujäämise.See on kooskõlas tähelepanekuga, et haruldased Specc11 mutantsed embrüod, mis pääsevad arreteerimisest St.E9.5 – võib-olla vähenenud geenipüüdmise efektiivsuse tõttu – suudavad sulgeda oma neuraaltorud ja peatuvad hilisemas arengus, sageli kraniofaciaalsete defektidega (joonis S3).Sellega on kooskõlas ka kraniofatsiaalsete kõrvalekalletega heterosügootsete Specc1l embrüote haruldane esinemine (tõenäoliselt suurenenud geenipüüdmise tõhususe tõttu) ning sebrakala avastus, mille puhul üks kahest SPECC1L ortoloogist (specc1lb) põhjustab hilise embrüo fenotüüpe, sealhulgas embrüo kaotust. alalõuad ja kahepoolsed lõhed51.Seega võivad inimpatsientidel tuvastatud heterosügootsed SPECC1L funktsioonikaotuse mutatsioonid põhjustada SPECC1L funktsiooni väikeseid kahjustusi kraniofaciaalse morfogeneesi ajal, mis on piisav nende orofatsiaalsete lõhede selgitamiseks.SPECC1L-põhine rakkudevaheliste kontaktide reguleerimine võib samuti mängida rolli neelukaarte palatogeneesis ja sulandumises.Täiendavad SPECC1L funktsiooni uuringud aitavad selgitada ajutiste rakkudevaheliste kontaktide rolli CNCC-s neuraaltoru sulgemise ajal neuroepiteelirakkude liikuvuses ja kraniofatsiaalses morfogeneesis.
U2OS osteosarkoomi kontrolli ja SPECC1L-kd rakke on varem kirjeldatud (Saadi et al., 2011).SPECC1L-vastaseid antikehi on ka varem iseloomustatud (Saadi et al., 2011).β-kateniinivastased antikehad (küülik; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (hiir; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), müosiin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-kadheriin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), lõhustatud kaspaas 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ja β-aktiin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) kasutati vastavalt kirjeldusele..Aktiini filamendid värviti Acti-värviga rodamiinfalloidiiniga (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS kontrollrakke ja SPECC1L-kd rakke kultiveeriti standardses kõrge glükoosisisaldusega DMEM-is, millele oli lisatud 10% veise loote seerumit (Life Technologies, Carlsbad, CA).AJ muutuste jaoks külvati 2 x 105 rakku 0,1% seaželatiiniga töödeldud klaasile (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja jälgiti muutusi raku kujus.Rakud koguti erinevatel näidatud ajahetkedel: 4 tundi pärast külvamist (t = 1), 24 tundi pärast külvamist (t = 2), liitumine ilma raku kuju muutumiseta (t = 3), raku kuju muutus (t = 4) , 24 tundi pärast raku kuju muutumist (t = 5) ja 48 tundi pärast raku kuju muutumist (t = 6) (joonis 1, 2, 3).PI3K-AKT raja moduleerimiseks kultiveeriti rakke näidatud kontsentratsioonides PI3K-AKT inhibiitori wortmanniiniga (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) või SC-79 aktivaatoriga (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Kemikaale sisaldavat söödet vahetati iga päev.
Kaaderhaaval salvestati eluskontrolli ja KD rakkudel normaalsetes kultiveerimistingimustes ning faasikontrastseid pilte koguti iga 10 minuti järel 7 päeva jooksul.Pildid saadi arvutiga juhitava Leica DM IRB pöördmikroskoobi abil, mis oli varustatud mehaanilise staadiumi ja QImaging Retiga-SRV kaameraga ühendatud 10 × N-PLAN objektiiviga.Pildistamise ajal hoiti rakukultuure 37 °C juures niiskes atmosfääris 5% CO2-ga.
Spec11 puudulike hiireliinide genereerimiseks kasutati kahte geenilõksu ES rakuliini DTM096 ja RRH048 Regional Mutant Mouse Resource Centerist (UC Davis, CA), tähistusega Specc1lgtDTM096 ja Specc1lgtRRH046.Lühidalt, 129/REJ ES rakud süstiti C57BL6 blastotsüstidesse.Saadud kimäärsed isased hiired aretati emaste C57BL6 hiirtega, et tuvastada agouti karvkatte värvusega järglasi.Heterosügootide tuvastamiseks kasutati geenilõksu vektori insertide olemasolu.Hiiri peeti segatud taustal 129/REJ; C57BL6.Geneetilise lõksu vektori sisestuskoha asukoht kinnitati RT-PCR, genoomi järjestamise ja geneetilise komplementatsiooniga (täiendav joonis 1).Topeltheterosügootsete Specc1lGT hiirte CNCC-liini jälgimiseks ristati ROSAmTmG (#007576) ja Wnt1-Cre (#003829) hiired (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), et saada Speccosl embrüos ROSAmTmG ja Wnt1-Cre mutant.Kõik katsed hiirtega viidi läbi vastavalt Kansase ülikooli meditsiinikeskuse institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee poolt heaks kiidetud protokollidele.
Embrüod fikseeriti (1% formaldehüüd, 0,2% glutaaraldehüüd, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) 60 minutit toatemperatuuril.Pärast fikseerimist X-gal värvimislahuses (5 mM kaaliumferritsüaniid, 5 mM kaaliumferrotsüaniid, 2 mM MgCl2, 0,01% naatriumdeoksükolaat, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) peitsi ilmutamine viidi läbi temperatuuril 37 °C .°C 1-6 tunni jooksul.Embrüod fikseeriti 4% PFA-s ja visualiseeriti.
Western blot analüüsi jaoks lüüsiti rakud passiivses lüüsipuhvris (Promega, Fitchburg, WI), millele oli lisatud HALT proteaasi inhibiitorite segu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lüsaate töödeldi 12% polüakrüülamiidi Mini-PROTEAN TGX valmisgeelidel (Bio-Rad, Hercules, CA) ja kanti Immobilon PVDF membraanidele (EMD Millipore, Billerica, MA).Membraanid blokeeriti 5% piimaga PBS-is, mis sisaldas 0,1% Tweeni.Antikehi inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C või üks tund toatemperatuuril.Signaali genereerimiseks kasutati Femto SuperSignal West ECL reaktiivi (Thermo Scientific, Waltham, MA).Immunovärvimiseks fikseeriti embrüod üleöö 4% PFA/PBS-is ja külmsäilitati.Kudede krüosektsioonid blokeeriti PBS-is, mis sisaldas 1% normaalset kitseseerumit (Thermo Scientific, Waltham, MA) ja 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ning seejärel inkubeeriti inkubaatoris temperatuuril 4 °C. öö.anti-antikeha ja fluorestseeruva sekundaarse antikehaga (1:1000) 1 tund temperatuuril 4 °C.Värvitud lõigud asetati ProLong kuldsöötmesse (Thermo Scientific, Waltham MA) ja lamedad kujutised saadi Leica TCS SPE konfokaalse mikroskoobi abil.Iga immunovärvimine viidi läbi kolme sõltumatu katsena vähemalt kahe mutantse embrüo tsirosektsiooniga.Näidatakse tüüpilist katset.
Rakke inkubeeriti modifitseeritud RIPA puhvris (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glütserool, 2 mM EDTA ja HALT proteaasi inhibiitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Lüsaadid eelpuhastati G-valgu magnethelmestega (Life Technologies, Carlsbad, CA) ja inkubeeriti seejärel üleöö 4 °C juures koos anti-SPECC1L või IgG valgu G-valgu helmestega, mida kasutati SPECC1L ekstraheerimiseks ja Western blotting viidi läbi antigeeniga. Eespool kirjeldatud -β-kateniini antikeha Näidatud ko-IP katsed esindavad nelja sõltumatut katset.
Fikseeritud kultiveeritud rakud või hiire embrüonaalsed kuded anti Kansase ülikooli meditsiinikeskuse elektronmikroskoopia keskusesse.Lühidalt, proovid sisestati EMbed 812 vaiku (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polümeriseeriti üleöö temperatuuril 60 °C ja lõigati 80 nm juures, kasutades Leica UC7 ultramikrotoomi, mis oli varustatud teemantteraga.Sektsioonid visualiseeriti JEOL JEM-1400 ülekandeelektronmikroskoobi abil, mis oli varustatud 100 kV Lab6 püstoliga.
Kuidas seda artiklit tsiteerida: Wilson, NR et al.SPECC1L puudulikkus suurendab splaissitud liigeste stabiilsust ja vähendab kraniaalnärvi harjarakkude delaminatsiooni.teadus.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Närviharja esilekutsumine ja diferentseerumine.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Kolju närviharja rakud liikumises: nende roll kraniofaciaalses arengus.American Journal of Medical Genetics.A-osa 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: selle kasv ja areng 20 aasta jooksul.Lastearst.patoloogia.laboris.ravim.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU ja Noten MM Läbimurre orofatsiaalsete lõhede geneetikas.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. ja Riley, FM Kraniaalnärviharja rakkude migratsiooni ja mustri kujundamise molekulaarsed mehhanismid kraniofaciaalse arengu ajal.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH ja Murray, JK Huule- ja suulaelõhed: geneetiliste ja keskkonnamõjude mõistmine.loomulik kommentaar.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Naha, jäsemete ja kraniofatsiaalse piirkonna ebanormaalne morfogenees interferooni reguleeriva faktori-6 (Irf6) puudulikkusega hiirtel.National Genette.38, 1335–1340, doi: 10,1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3 domineerivad mutatsioonid põhjustavad van der Waordi sündroomi ja kahjustavad suu peridermi arengut.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ja Juriloff, DM Värskendage närvitoru sulgumise defektidega hiiremutantide loendit ja liikuge närvitoru sulgemise täieliku geneetilise mõistmise poole.Sünnidefektide uurimine.A osa, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-vahendatud PDGFRalpha signaaliülekanne reguleerib ellujäämist ja proliferatsiooni skeleti arengus p53-sõltuva rakusisese raja kaudu.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND ja Murdoch, JN Disheveled: konvergentse laienemise seos neuraaltoru sulgemisega.Neuroloogia suundumused.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).